185603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására
1 185 603 2 kvantitatív precipitációs teszttel is kimutathatjuk. Jól értékelhető kvantitatív precipitációs görbéket kapunk és ezekből kiszámíthatjuk a specifikus antitestek míkrogrammjait. További'bizonyságot nyerhetünk a szérumban lévő specifikus antitestek jelenlétéről, ha az anti-astrocytin antitestet brómacetil-cellulóz-astrocytinra (BAC-astrocytin) abszorbeáltjuk. A specifikus antí-astrocytint tartalmazó antiszérumot a BAC-astrocytinnel reagáltathatjuk. Ha a szérumot BAC-astrocytinen engedjük keresztül, akkor csak az astrocytin specifikus antitestjei kapcsolódnak a specifikus antigénjükhöz: az astrocytinhez. Mivel az astrocytin kovalensen kapcsolódik a brómacetilcellulózhoz,a specifikus antitest: az anti-astrocytin most a BAC-astrocytinhez kötődik és így BAC-astrocytin-antiastrocytin (BACA-Anti-Astrocytin) keletkezik. Erről úgy győződhetünk meg, hogy a szérum maradékát, amelyből kimossuk a BAC-astrocytint, vizsgáljuk. A standard Ouchterlony diffúziós teszt ez esetben nem mutat ki a szérumban antitestet, amely astrocytinnel reagálna. Ez azt mutatja, hogy a szérumban korábban kimutatott anti-astrocytin antitestek teljes egészében abszorbeálódtak a BAC-astrocytinre. Amikor tehát az anti-astrocytin felszabadul az BAC-astrocytin kötésből, ekkor valamennyi szennyeződéstől izolálódik. Az anti-astrocytin felszabadítását elvégezhetjük a BAC anti-astrocytin 0,25 mólos ecetsavval történő mosásával, melyet 2 óráig és 4 °C-on végzünk és ez nem bontja fel a BAC-astrocytin kötést. További bizonyítékot nyerhetünk a szérum specifikus antitest-tartalmáról, ha az anti-malignin specifikus antitestet brómacetil-cellulóz-maligninre (BAC-malignin) ab-! szorbeáljuk. A specifikus anti-malignint tartalmazó antiszérumot BAC-maligninnel reagáltathatjuk. Ha a szérumot BAQmaligninen engedjük keresztül, csak a malignin antitestjei kapcsolódnak specifikus antigénjükhöz, a maligninhez. Mivel a malignin kovalensen kötődik a brómacetil-cellulózhoz, a specifikus anti-malignin antitest most a BAC-maligninhez kötődik és így kapjuk a BAC-malignin-anti-malignint (BAC-M-anti-malignin). Ennek kimutatására szolgál, ha a szérum maradékát mosással megszabadítjuk a BAC-malignintől és úgy vizsgáljuk. Standard Ouchterlony diffúziós teszt során a szérumban nem marad olyan antitest, amely maligninnel reagálna. Ez tehát arra mutat, hogy az előzőleg a szérumban jelenlévő valamennyi anti-malignin antitest abszorbeálódott a BAC-maligninra. Továbbá, ha az antimalignint felszabadítjuk a BAC-malignin kötésből, valamennyi szennyező antitesttől megszabadítjuk. Az antimalignin felszabadítását elvégezhetjük a BACM-antimalignin komplex 0,25 mólos ecetsavval 4 °C-on történő 2 órát tartó mosásával, ami által a BAC-malignin kötés nem bomlik fel. A „cél” antitestjei a „cél”-lal reagálva standard Ouchterlony-gél diffúziós teszt során az antigén-antitest reakcióra specifikus önálló reakciósávokat mutatnak, melyek azonosak az anti-astrocytin és anti-malignin antiszérumok reakcióinak sávjaival (azaz az astrocytin és malignin beoltásával kapott anyagok). Bizonyos nyulak vérében a „céT’-lal történő beoltás előtt „anti-célt” mutattak ki. Ha ezek az „anti-cél” vegyületek „cél”-reagensekkel reagálnak (1. a humán szérum vizsgálatának alábbi leírását), közel ekvivalens mennyiségű két típusú TAG-ot kapunk; az S-TAG-ot és az F-TAG-ot (lásd: alábbi példák). 8. példa (Referencia példa) Az alábbi példa — bár nem tartozik a találmány oltalmi köréhez - bemutatja a TAG-vegyületek eddig ismert rák-kimutatási lehetőségét. Rosszindulatú daganatok kimutatására TAG-vegyületek biológiai folyadékokból történő kvantitatív előállításával: ___ A 6. példa szerint kapott „cél’’-reagenst az elbomlás következtében jelenlévő kötetlen recognin eltávolítására mossuk. Az alábbi eljárás kielégítő. A ,,cél”-reagenst 2 óra hosszat 37 °C-on kevertetjük 0,25 mólos ecetsavval, majd centrifugáljuk és a felülúszót dekantáljuk és a felülúszó optikai sűrűségét 266 mp-nál olvassuk le. Ha abszorpciót tapasztalunk, a mosást addig ismételjük, amíg további anyag már nem oldódik ki. A ,,cél”-vegyületet ezután pH = 7,2 értékű foszfát-pufferben újraszuszpendáljuk. A „cél”-vegyület vizsgálatához szükséges referencia standardként az alább leírt módon humán szérum tisztításával kapott standard S-TAG-ot és F-TAG-ot használhatunk vagy egész nyúlszérum is alkalmas erre a célra, amely más „cél”-reagensekkei kimutatva S-TAG-ot és F-TAG-ot tartalmaz. Az S-TAG meghatározás az alábbi módon megy végbe: Pár napnál tovább tárolt fagyasztott szérumot nem használunk. A szérumot óvatosan állítjuk elő frissen kapott vérből vagy más testfolyadékból az irodalomból ismert módszer segítségével. Az alábbi eljárás mutatkozott kielégítőnek: A vért két óráig szobahőmérsékleten hagyjuk megalvadni egy üveg kémcsőben. A csomókat üvegkeverő pálcával elválasztjuk a kémcső falától és a vért 4 C-on legalább 2 óráig (vagy egész éjjel) állni hagyjuk. A vérrögöket 20 000 ford/perc melletti 45 percig tartó centrifugálássa1 4 °C-on választjuk el a szérumtól. A szérumot egy centrifugacsőbe dekantáljuk és 2000 percenkénti fordulatszámmal 4 °C-on 45 percig ismét centrifugáljuk. A szérumot dekantáljuk és 1%-os merfiolát[-(o-etilmerkuritio|-benzoesav)] oldatot (1 g 95 ml vízben ás 5 ml 0,2 mólos hidrogén-karbonát pufferben pH= 10) adunk hozzá a szérum térfogatának 1 %-áig terjedő mennyiségben. A fenti vagy más módszerekkel előállított szérummirtákat adagoljuk 0,2 ml mennyiségben a 100-200 mikrogramm recognint tartalmazó 0,25 ml-es „cél”reagens szuszpenzió aliquotokhoz, két párhuzamos meghatározást végezve. A szuszpenziót 4 C-on oly módon keverjük, hogy a pelletképződést megakadályozzuk. Így például egy kis gumisapkát használhatunk, melyet gyorsan 1—2 másodpercig rázunk, majd a csöveket enyhén megdöntjük, majd Thomas-féle keverőben 2 óráig vagy tovább is keverhetjük. A „cél”-reagenst és a hozzákapcsolódó proteint a szérumtól elkülönítjük. Az egyik kielégítőnek bizonyult lépést az alábbiakban ismertetjük: A csöveket 2000 percenkénti fordulatszám mellett 20 percig 4 °C-on centifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk és a centrifugálás közben képződött pelletet háromszor mossuk, szobahőmérsékleten 0,2-0,3 ml 0,15 mólos sóoldattal történő újra felkeveréssel és rázással, majd centrifugáljuk és a felülúszókat eltávolítjuk. A„cél”-hoz kapcsolódó proteint lehasítjuk a „cél”-ról és mennyiségileg meghatározzuk, pl. 0,2 ml 0,25 mólos ecetsavat adunk hozzá, a szuszpenziót 1-2 óra hosszat 37 °C-os inkubátorban rázzuk. A csöveket 2000 percenkénti fordulatszámmal 4 °C-on 30 percig centrifugáljuk. A felülúszót óvatosan dekantáljuk, hogy a részecskéket 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
