185603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására
i 185 60Î 2 Az 1. ábra a termelt malignin mennyiségét ábrázolja a rosszindulatúság fokának függvényében. Az ordinátán a rosszindulatú sejtképződmények szerepelnek az összes termelt protein mg-jában és az abszcisszán a termelt malignin szerepel az összes protein %-ában kifejezve. Az 1. ábra azt mutatja, hogy a nagyobb lombikméret mintegy megháromszorozza a malignin termék mennyiségét. Az 1. ábra a malignin és a rosszindulatúság közötti összefüggést is megmutatja. A szaggatott vonal ideális lineáris összefüggést mutat. Ez az összefüggés nyilván nem triviális, mert a jelenlévő maiígnín mennyisége úgy nő, ahogy a sejtek növekedése patologikussá, fékezetlenné válik. A normális in situ recognin működés a fentiek szerint a sejtek növekedésének érintkezés útján történő gátlására vonatkozik. Minél kórosabbá válik a rosszindulatú sejtek növekedése, annál kevésbé működik az érintkezés útján végbemenő gátlás, és annál inkább válik a malignin domináló proteinné. Az 5 A. példa tehát azt szemlélteti, hogy a mesterséges ráksejt tenyésztés nagyobb méretű edényben váratlanul fokozza a malignin termelést, azaz az összes termelt protein százalékát, ez a több malignin termelésnek felel meg. A nagyméretű tenyésztő edény olyan edény, amelyben az edény térfogatának és a sejteket tartalmazó közeg térfogatának aránya a 3. példa szerinti módszernek megfelelően nagyobb vagy egyenlő, mint 8 :1. Az 5A. példában ez az arány 8:1. 6. példa ,,Cél”-reagensek előállítása recogninokból. A 2. példa szerint előállított astroeytínt vagy az 5. példa szerint előállított maligniní egy hordozóval együtt komplexszé alakítjuk és így ,,cél”-reagenst kapunk. Az eljárás előnyös foganatosítási módja szerint astroeytínt vagy malignint pH = 4 értékű, 0,15 mólos nátrium-dihidrogén-foszfátcitrát pufferben feloldunk. Brómacetil-gyantát, például 1 gram cellulózban 1,0-1,5 milliekvivalens brómot tartalmazó brómacetil-cellulózt (BAC), melyet hidegen tárolunk, 0,15 mólos, pH = 7,2 értékű NaH2P04 pufferben készítünk el. A puffer pH- értékét a pH = 7,2 értékű puffer leöntésével és 0,15 mólos NaIí2P04-citrát puffer hozzáadásával 4-re állítjuk. Az astroeytin vagy malignin oldatot és a BAC oldatot (BAC : RECOGNIN aránya 10:1) szobahőmérsékleten 30 óra hosszat keverjük, majd centrifugáljuk. Előnyösen a RECOGNIN a BAC valamennyi hozzáférhető oldalához kötődik. Az előző lépésből származó felülúszót liofilizáljuk és a BAC-al komplexet még nem képzett astroeytin vagy a malignin mennyiségének kimutatására meghatározzuk a proteintartalmat. A BACRECOGNIN vagy a BAC-MALIGNIN komplexet 0,1 mólos pH = 8,9 értékű nátrium-hidrogén-karbonát pufferben újra szuszpendáljuk, 24 óra hosszat 4 °C-on keverjük, ezáltal a BAC és az ASTROCYTÍN vagy a MALIGNIN között létrejönnek a kémiai kötések. 24 óra múlva a szuszpenziót centrifugáljuk és meghatározzuk a felülúszó protein-íartalmát. A komplex BAC-ASTROCYTIN-t vagy BAC-MALIGNIN-t 0,05 mólos aminoetanolban és 0,1 mólos hidrogén-karbonát pufferben 12 (pH = 8,9) újraszuszpendáljuk, hogy az esetleg nem reagált brómot blokkoljuk. A szuszpenziót centrifugáljuk és a felülúszót megtartjuk, de az aminoetanol-taralom miatt nem analizáljuk. A meg nem kötött astro- 5 cytint és malignint centrifugálással és háromszor 0,15 mólos nátrium-kloridos mosással történő újraszuszpendálással eltávolítjuk, amíg a mosott anyag spektrofotométerrel már nem mutat abszorpciót 266 m/r-nál. A kapott komplexeket ezután 2 óra hosszat 38 °C-on 8 mólos 10 karbamidban keverjük, centrifugáljuk, majd általában háromszor mossuk 8 mólos karbamiddal, amíg a mosott termék 266 mp-nál már nem mutat abszorpciót. A komplexet ezután 0,15 mólos nátrium-kioriddal kétszer mossuk és így eltávolítjuk a karbamidot. A komplexet 15 ezután 37 °C-on 0,25 mólos ecetsavban 2 óráig kevertetjük, hogy stabilitását demonstráljuk. Centrifugálás után a felülúszónak 266 mp-nál nem szabad abszorpciót mutatni. A kémiai komplexek tehát igen stabilak és az alábbi módszereknél ezért jól hasznosíthatók. Ebben a 20 stabil reagens formában a kapott terméket szintetikusan előállított komplexnek fogjuk fel, amelynek fizikai és kémiai tulajdonságai a stabil, sejthez kötött astroeytin és malignin-prekurzor tulajdonságait mutatják, ha ez1 a komplex a szérum komponensekkel potenciálisan 25 reakcióképes állapotban van. Tárolás céljából a „cél”reagenst centrifugáljuk és addig mossuk pH = 7,2 értékű NaH2P04 pufferrel, amíg nem semlegesítjük. A „cél”-vegyületeket hordozóként brómacetil-cellulózon kívül más bróm-acetiiezett ligandummal is előállít- 3C hatjuk, például brómacetilezett gyantákat vagy még szűrőpapírt is használhatunk. 35 7. példa Astroeytin, malignin és „cél” aníiszérumainak előállítása: 40 Az astroeytin, malignin és „céi” reagensek antiszérumait úgy állíthatjuk elő, hogy antitest reakciót idézünk elő emlősökben. Az alábbi módszer kielégítőnek mutatkozott. 1 mg recogninnal (astrocytinnal vagy maiigninnal) 45 standard Freund-féle adjuváns segítségével beoltjuk fehér hím nyulak lábfejét, majd ugyanezt az injekciót egy hét múlva intraperitoneálisan, tíz nap múlva ismét intraperitoneálisan és szükség esetén három hét múlva ismét megismételjük. A nyulak. vérszérumában már egy héttel 50 vagy tíz nappal az első injekció után specifikus antitesteket lehetett kimutatni. Ugyanezt az eljárást követjük a „céi”-antigén kiváltásához is. 1 mg astroeytínt vagy malignint tartalmazó „céT’-vegyületet fecskendezünk be és a ,,cél” astroeytin vagy malignin-tartalmát 55 Folin- Lowry fehérje-meghatározó módszerével határozzuk meg. Az astroeytin antitestét anti-astroeytinnek nevezzük. A malignin antitestét anti-maligninnek nevezzük és hasonló módon a ,,cél”-reagens antitestét anti■ „céR-nak nevezzük. 00 Ezek az antitestek specifikus antigénjeikkel reagálva az antigén-antitest reakciók standard Ouchterlony-gél diffúziós tesztjében specifikus önálló, éles reakciósávot mutatnak. A szérumban lévő specifikus antitestek jelenlétét az 55 antigén-antitest reakciók kimutatására szolgáló standard
