185416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin- vagy inzulin analógok előállítására

1

185 416

2

Minta száma Merkaptan -SH/SSOj

fÁl

Inzulin Kapcsolás kitermt

mg/ml %

1

34,/

5ME

0,5

0,515

6,0

2

83

ME

1,2

0,770

9,2

3

97

ME

1,4

0,718

8,7

4

138

ME

2,0

0,470

5,8

5

207

ME

3.0

0,274

3,6

6

34,1

5 MEA

0,5

0,529

6,1

7

83

MEA

1,2

0,672

8,1

8

97

MEA

1,4

0,629

7,6

9

138

MEA

2,0

0,457

5,7

10

207

MEA

3,0

0,261

3,4

A táblázatból látható, hogy az ME és MEA — SH/SSCTj optimuma egyaránt 1,25. Bár a kitermelési értékek nem olyan magasak, a kapcsolási reakció ezen merkaptánokkal is végbemegy.

A következő kísérletben az A- és B-lánc S-sznlfonátok kapcsolási reakciójában a cisztcin és DTT szerepét vizsgáljuk.

Az A- és B-lánc S-szulfonát egyesített oldatait az előzőekben megadottak szerint készítjük. 121,2 mg ciszteint 3,35 ml, 0,1 mól pH =10,5 értékű pufferral

oldunk, és 61,7 mg DTT-t 4,14 ml hasonló pufferral oldunk. A pH-értékekct 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 20 10,5-re állítjuk. Az A- és B-lánc S-szulfonát-oldat 1,4 ml mintáihoz különböző mennyiségű cisztein- és DTT- oldatokat adunk, és a mintákat egy éjszakán át 6 °C 'Hőmérsékleten nyitott, 3 ml-cs fiolákban tartjuk.

A mintákat HPLC-analízissel vizsgáltuk, és a ki terme - 25 :ési értékeket és az —SH/SSOj arányt az előzőekben megadottak szerint határozzuk meg.

Minta száma

Merkaptán

id

—SH/SSOj

Inzulin

mg/ml

Kapcsolási kitermelés,

%

1

75

DTT

0,90

0,684

9,0

2

100

DTT

1,20

1,645

22,0

3

109

DTT

1,30

1,783

24,0

4

117

DTT

1,40

1,237

16,8

5

134

DTT

1,60

1,131

15,5

6

159

DTT

1,90

0,500

7,0

7

43,

5 Cys

0,80

1,184

15,2

8

54

Cys

1,00

1,493

19,4

9

60

Cys

1,10

1,711

22,3

10

65

Cys

1,20

1,658

21,7

11

71

Cys

1,30

1,711

22,5

12

81,

5 Cys

1,50

1,467

19,4

13

103

Cys

1,90

1,112

13,9

A táblázatból látható, hogy cisztein alkalmazása mellett a legjobb kitermelés a DTT alkalmazásánál kapott legjobb inzulin kitermelésének csak 94 %-a, ugyanakkor az optimális —SH/SSO3 arány cisztein esetén szélesebb.

13. példa

A következő kísérletben az A- és B-lánc S-szulfonátok kapcsolási reakciójában a hőmérséklet szerepét vizsgáljuk a reakció konverziós fokára és az inzulin-kitermelésre.

55 149 mg sertés A-lánc S-szulfonátot és 70 mg E. coli

(trpE) B-lánc S-szulfonátot oldunk 14,9, illetve 7,0 ml, 0,1 mól glicin-pufferban, és az oldatok pH-értékét 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk. 61,7 mg DTT-t 4 ml pufferban oldunk, majd az oldat pH-értékét 60 i40 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk.

Három különböző mintát készítünk, különböző hőmérsékleten, 15 ml-es fiolákban. Ezek összetételét az alábbi táblázat mutatja. Az oldatok egyesítését —1 °C 1 őmérsékleten végezzük. A kísérletek során az A-lánc 65 és B-lánc oldat aránya 2,0, és az —SH/SSOj érték 1,11.

10