185416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin- vagy inzulin analógok előállítására
1 185 416 2 Minta száma ml A ml B pl DTT Hőmérséklet 1 4,0 2,0 3,90 0 °C (jégfürdő) 2 4,0 2,0 3,90 6 °C (hűtőszoba) 3 4,0 2,0 3,90 22 °C (szobahőmérséklet) Különböző időpontokban a mintákból ecetsawal 1: 2 arányú hígításokat készítünk, és humán inzulin tartalmukat HPLC-analízissel vizsgáljuk. Standardként UV27Í -an.ilizált sertés R — 0,2). inzulint használtunk (15,5 mm2/pg, Idő 1-es számú minta Inzulin mg Kapcsolás, % Idő 2-es számú minta Inzulin mg Kapcsolás, % Idő 3-as számú minta Inzulin mg Kapcsolás, % 35 perc 3,08 5,1 30 perc 3,80 6,3 4 perc 1,79 3,0- 87 p. 4,94 8,2 60 p. 5,01 8,4 20 p. 3,08 5,1 2 ó. 25 p. 6,23 10,4 100 p. 6,09 10,2 40 p. 3,44 5,7 3 ó. 3 p. 8,02 13,4 2Ó.40 P-8,31 13,9 2 ó. 5,16 8,6 4 ó. 8,88 14,8 3 ó. 37 P-10,17 17,0 3 ó. 14 p 5,87 9,8 5 ó. 52 p. 10,60 17,7 5,5 ó. 10,89 18.2 5 ó. 7 p. 5,33 8,9 Az előző mintákat körülbelül 1 nap elteltével ismét analizáltuk, és megállapítottuk a végső inzulin-kitermelést. Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja: Minta száma Idő HPLC összes inzulin mg Protein kapcsolás kitermelése, % 1 23 ó. 27 p. 1351 14,83 24,7 2 23 ó. 3 p. 1350 14,61 24,4 3 22 ó. 40 p. 1349 2,87 4,8 A fenti táblázatból látható, hogy szobahőmérsékleten 45 a kapcsolási reakció gyorsan kezdődik, azonban hamar (kb. 3 óra alatt) viszonylag alacsony inzulin-kitermelésnél (9,8 %) leáll, majd a reakcióelegyből az inzulin-tartalom lassan csökken. 6 °C hőmérsékleten az inzulin kissé gyorsabban képződik, mint 0 °C hőmérsékleten, mintegy 50 6 óra időtartamig, a végső kapcsolási kitermelések azonban gyakorlatilag azonosak. Ez utóbbi két esetben nem tapasztalható inzulin-bomlás. A fenti táblázatokból kiszámoltuk a t1(r2 (max) értékeket, azaz azt az időt, amely alatt a maximális inzulinmennyiség fele termelődött. Ezen értékeket az alábbi táblázat mutatja: Minta száma T°C Maximális inzulin kitermelés, % ti/2 (max) 1 O O O 24,7 171 2 6°C 24,4 126 3 22 °C 9,8 18 A fenti táblázatokból összefoglalva megállapítható, hogy a lánckapcsolási reakció 0°C hőmérsékleten és szobahőmérsékleten lassúbb, azonban azonos végső inzulin-kitermelést ad. Szobahőmérsékleten gyengébb kitermelési értékeket kapunk. 11
