185416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin- vagy inzulin analógok előállítására

1

185 416

2

Minta száma

Merkaptán SHISSCT Inzulin Ml 3 mg/ml

Kapcsolás kitermelése,

%

1

34,5 MPS

0,5

0,272

3,2

2

83 MPS

1,2

1,179

14,2

3

97 MPS

1,4

1,376

16,6

4

138 MPS

2,0

0,952

11,9

5

207 MPS

3,0

0,771

10,0

6

34,5 MBS

0,5

0

0

7

83 MBS

1,2

0,038

0,4

8

97 MBS

1,4

0,083

1,0

9

138 MBS

2,0

0,136

1,7

10

207 MBS

3,0

0,053

0,7

A fenti táblázatból látható, hogy a (3-merkaptopropionsav igen jó inzulin-kitermelést biztosít, melynek SH/SSO3 = 1,40 optimuma magasabb, mint DTT és cisztein esetén.

A következő kísérletben az A- és B-lánc S-szulfonátok kapcsolási reakciójában a merkapto-ecetsav (MES) és o-merkapto-benzoesav (OMBS) szerepét vizsgáljuk.

Sertés A-lánc S-szulfonátból és E. coli B-lánc S-szulfonátból pH = 10,5 értékű 1 mól glicin-pufferral 10 mg/ml koncentrációjú törzsoldatot készítünk. Ebből a minták készítéséhez 1,4 ml-es térfogatokat használunk.

20

25

71 m1 MES-t 3,9 ml, 0,1 mól glicin-pufferban oldunk, majd pH-ját 300 mI 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5-re állítjuk. 154,2 mg OMBS-t 3,8 ml, 0,1 mól glicin-pufferban oldunk, és pH-ját 10,5-re állítjuk.

A mintákat 6 °C hőmérsékleten egy éjszakán át keverjük, majd HPLC-analízissel vizsgáljuk. Az inzulin kitermelési értékeket a 9. példában leírtak szerint határozzuk meg. Az alábbi táblázat a minták készítésének módját és a kitermelési értékeket mutatja:

Minta száma

Merkaptán

Ml-SH/SSO3

Inzulin

mg/ml

Kapcsolás kitermelése,

%

1

34,5 MES

0,5

0,615

7,2

2

83 MES

1,2

1,638

19,7

3

97 MES

1,4

1,738

21,1

4

138 MES

2,0

1,646

20,5

5

207 MES

3,0

0,469

6,1

6

34,5 OMBS

0,5

0,169

2,0

7

83 OMBS

1,2

0,662

8,0

8

97 OMBS

1,4

0.692

8,4

9

138 OMBS

2,0

0,669

8,4

10

207 OMBS

3,0

0,662

8,6

A fenti táblázatból látható, hogy elsősorban a merkapto-ecetsav a DTT és cisztein alkalmazásával végzett kapcsoláshoz hasonló jó kitermeléseket ad, ugyanakkor az —SH/SSOi optimuma igen széles.

A következő kísérletben az A- és B-lánc S-szulfonátok 55 kapcsolási reakciójában a /3-merkapto-etanol (ME) vagy cisztamin (merkapto-etil-amin, MEA) szerepét vizsgáljuk.

Sertés A-lánc S-szulfonátból és E. coli B-lánc S-szulfonátból pH =10,5 értékű, 0,1 mól glicin-pufferral 10 mg/ml-es törzsoldatot készítünk. Ebből a minták készíté- 60 séhez 1,4 ml-es térfogatokat használunk.

70 jul (3-merkapto-etanolt 4,0 ml, 0,1 mól glicin-pufferban oldunk, majd pH-értékét 5 n nátrium-hidroxidoldat hozzáadásával (200 m0 10,5-re állítjuk. 113,6 mg MEA-t 4,0 ml, 0,1 mól glicin-pufferban oldunk, majd az oldat pH-értékét 200 ,ul 5 n nátrium-hidroxid-oldattal

10,5-re állítjuk.

A mintákat 6 °C hőmérsékleten egy éjszakán át keverjük, majd HPLC-analízissel vizsgáljuk. Az inzulin kitermelési értékeket a 9. példában megadottak szerint határozzuk meg.

9