185416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin- vagy inzulin analógok előállítására

1

185 4 [6

2

Minta száma

4-6 óra inzulin

1 nap inzulin

mg/ml kitermelés, % mg/ml

kapcsolás, %

0

0,62

6,5

0,81

9,2

1--1,22

13,4

2

1,63

17,5

1,74

18,7

3--2,02

21,6

4

1,89

20,2

2,17

23,1

5--2,01

21,5

6

1,61

17,3

1,72

18,4

7

0,91

9,8

1,18

12,7

A fenti táblázatból látható, hogy az A- és B-lánc kap-15

Sertés A-lánc S-szulfonátból és

E. coli B-lánc S-szulcsolásának optimális kezdeti pH-értéke 10,5.

fonátból pH= 10,5 glicin-pufferral 10 mg/ml-es oldatot

készítünk.

Szabad L-cisztein bázisból (ms =

121,16) 121,2 mg-ot

12. példa

20

3,0 ml, 0,1 mólos glicin-pufferban oldunk, majd az oldat pH-értékét 350 pl 5 n nátrium-hidroxid-oldattal 10,5-re

A következő példában a cisztein szerepét vizsgáljuk

állítjuk. Az A- és B-lánc elegyének 1,4 ml oldataihoz

az A- és B-lánc S-szulfonát kapcsolási reakciójában.

különböző mennyiségű cisztcin-oldatot adunk. A reak-Ezenkívül vizsgáljuk

a 0-merkapto-propionsav, ß-mer-ciót 6

C hőmérsékleten 17—21

órán át végezzük.

kapto-borostyánkősav, merkapto-etanol és DTT, illetve

25

Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja:

ezek ciszteinnel alkotott keverékének hatását.

Minta száma

Cisztein

hl

—SH/SSOj

Inzulin

mg/ml

Kapcsolás kitermelése,

%

1

26

0,5

0,640

7,4

2

47

0,9

1,520

17,7

3

57

1,1

1,917

22,5

4

62

1,2

1,975

23,3

5

67

1,3

1,917

22,7

6

72

1,4

1,750

20,8

7

88

1,7

1,479

17,7

8

104

2,0

1,192

14,5

9

129

2,5

0,849

10,5

10

155

3,0

0,515

6,5

A táblázatból látható, hogy a reakció —SH/SSO3 lefutása lényegében hasonló a DTT adagolásával végzett kapcsolási reakció lefutásához. Az így kapott 23,3 %-os kitermelés lényegében hasonló a DTT alkalmazása esetén kapottakhoz, és mindkét esetben az optimális kitermelést az —SH/SSOi = 1,2 aránynál kapjuk. Így a cisztcin az A- és B-lánc kapcsolásában a DTT helyett alkalmazható :

A következő kísérletben az A- és B-lánc S-szulfonátok kapcsolási reakciójában a 0-merkapto-propionsav (MPS) vagy merkapto-borostyánkősav (MBS) szerepét vizsgáljuk.

Sertés A-lánc S-szulfonátból és E. coli B-lánc S-szulfonátból pH = 10,5 értékű 1 mól glicin-pufferral lOmg/ml koncentrációjú oldatot készítünk. E törzsoldatból a min- 50 ták készítéséhez 1,4 ml-es térfogatokat használunk.

87 /il MPS-t 4,0 ml, 0,1 mól glicin-pufferban oldunk, majd 200 fii 5 n nátrium-hidroxid-oldattal pH-értékét

10,5-re állítjuk. 150,1 mg MBS-t 3,5 ml, 0,1 mól glicinpufferban oldunk, majd 700 pl 5 n nátrium-hidroxid- 55 oldattal pH-értékét 10,5-re állítjuk be.

A mintákat 6 °C hőmérsékleten egy éjszakán át keverjük, majd HPLC-analízissel vizsgáljuk. Az inzulin kitermelési értékeket a 9. példában leírtuk szerint határozzuk meg. Az alábbi táblázat a minták készítésének módját 60 és a kitermelési értékeket mutatja:

8