185416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin- vagy inzulin analógok előállítására
1 185 416 2 Valódi lánc-Minta száma Kiindulási pH pH-beállító oldat Inzulin mg/ml kapcsolási kitermelés %-a 1 7,4 22 p\ 6 n HCí 0 0 2 8,5 18/xl 6 n HCÎ 0,327 4,0 3 9,0 12 m1 6 n HCi 0,813 10,0 4 9,5 5 m1 6 n HCi 1,284 15,8 5 10,0 5 m1 1 n HCi 1,659 20,4 6 10,5 5 Ml 5 n NaOH 2,113 26,0 7 11 10 m1 5 n NaOH 1,659 20,4 8 11,5 15 Ml 5 n NaOH 1,308 16,2 9 12,1 20 m1 5 n NaOH 0,048 0,6 pH-értéküket 5 n nátrium-hídroxid-oldat hozzáadásával 10,5-re állítjuk vissza. 61,7 mg ditio-eritroitolt (DTT)4,0 ml, 0,1 mól glicinpufferban oldjuk, majd pH-értékét 140 ^1 5 n nátriumhiiroxid-oldat hozzáadásával 10,5 pH-értékre állítjuk vissza. A fenti oldatokat az egyes reakcióelegyek készítése közben jégen tartjuk. Mindegyik mintát a következő minta készítése előtt teljesen elkészítünk. Az alábbi táblázatban szereplő mintákat úgy készítettük, hogy a reagenseket meghatározott sorrendben 3 ml-es nyitott fiolákba adagoltuk, majd 6 °C hőmérsékletű hűtőszobákban mágneses keverővei kevertük. A pH- értékeket igen gyorsan és pontosan állítottuk be. A táblázatban szereplő végső pH-érték a reakció beindításakor 6 °C hőmérsékleten mért érték. Minta száma A-lánc ml B-lánc ml DTT Ml Végső pH Beállító oldat 0 1,0 0,5 100 9,0 100 Ml 1 n HCI 1 1,0 0,5 100 9,5 50 Ml 1 nHCl 2 1,0 0,5 100 10,0 16 Ml 1 nHCl 3 1,0 0,5 100 10,3 2 Ml 1 n HCI 4 1,0 0,5 100 10,5 1 m1 5 n NaOH 5 1,0 0,5 100 10,7 3 m1 5 n NaOH 6 1,0 0,5 100 11,0 10 m! 5 n NaOH 7 1,0 0,5 100 11,5 25 m! 5 n NaOH A mintákat HPLC-analízissel 24—27 órás reakcióidő elteltével vizsgáltuk, a mintákat 1:2 arányban jégecettel hígítva. 20 A táblázatból látható, hogy a pH-érték optimuma 10,5. 11. példa 25 A következő példában az A- és B-lánc ditio-erítroitol jelenlétében végzett kapcsolási reakciójának pH-függését vizsgáljuk a 10,5 körüli tartományban. 0,1 mól pH =10,5 értékű glicin-pufferral 12 ml, 30 10 mg/ml koncentrációjú sertés A-lánc S-szulfonátoldatot, illetve 6,0 ml, 10 mg/ml koncentrációjú E. coli (trpE) humán B-lánc S-szulfonát-oldatot készítünk, és 4—6 órás reakció után a mintákat közvetlenül HPLC- analízissel vizsgáltuk, majd a mérést 1 nap elteltével megismételtük. Az alábbi táblázat a HPLC-analízis értékeit mutatja, sertés inzulin standarddal szemben. 7
