185416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin- vagy inzulin analógok előállítására
1 185 416 2 A találmány tárgya új eljárás inzulin előállítására. Azóta, hogy DNS-rekombinációs módszerrel fehérjetermékek szintézise, és különösen ezen módszerrel inzulin A-lánc és inzulin B-lánc előállítása lehetővé vált [Goeddel és mtsai.: Proc. Nat’l. Acad. Sei., USA, 75, 106—110 (1979)], rendkívül megnövekedett annak a szükségessége, hogy az inzulin képzésére, az A- és B-lánc egyesítésével hatásos módszert dolgozzanak ki. Jellemzően, az A- és B-lánc egyesítésének korábbi módszerében, az inzulin termeléséhez kiindulási anyagként az A- és B-láncot stabil S-szulfonátjaik formájában használják. Általában, az A- és B-láncú S-szulfonátokat külön vagy együtt, szokásosan nagy feleslegű tiol-redukálószer alkalmazásával megfelelő szulfhidril-vegyületekké redukálják. A terméket ezután, ha nem együtt redukálták, a redukáló elegyből elkülönítik és együtt egy oxidáló közegbe, például levegő, viszik, hogy az A- és B-láncok egyesítése inzulinná végbemenjen. Ezen metodika példáit Du és munkatársai: Scientia Sinica 10, 84-104 (1961); Wilson és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 62, 483—489 (1962); Du és munkatársai: Scientia Sinica 14, 229—236 (1965); Kung és munkatársai: Scientia Sinica 15, 544-561 (1966); Kexue Tongbao (Kínai Köztársaság) 17, 241-277 (1966) és Markussen: J. Acta Paediatrica Scandinavica, Suppl. 270, 121 — 126 (1977) közleményeiben találjuk. Az előbbi eljárás módosítása abból áll, hegy az A- láncú S-szulfonátot redukálják, majd a redukált A-láncot B-láncű S-szulfonáttal oxidáló atmoszférában reagáltatják: lásd például Katsoyannis és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sei. (USA) 55, 1554-1561 (1966); Katsoyannis: Science 154, 1509—1514 (1966); Katsoyannis és mtsai: Biochemistry 6, 2642—2655 (1967); 3 420 810 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom és Jentsch: Journal of Chromatography 76, 167—174(1973). A másik módosítás magába foglalja az A-lánc szulfhidril vegyületének parciális oxidálását diszulfiddá az A-6 és A-ll cisztein-részek között, majd a termék B- láncú szulfhidrillel, vagy B-láncú S-szulfonáttal való oxidálását: lásd például 676 069 számú belga szabadalmi leírás és Zahn és mtsai: Liebigs Ann. Chem, 691, 225- 231 (1966). Mindegyik előbbi módszerben azonban egy elem közös, mégpedig az inzulin termelése két egymástól külön, egymást követő művelettel, nevezetesen az S- szulfonát redukciója szulfhidrillé, majd az ezt követő oxidálás diszulfiddá. Dixon és munkatársai a Nature 188, 721-724 (1960) közleményben olyan körülményeket ajánlanak, melyben az A- és B-láncú S-szulfonátok inzulinná történő átalakításához egyetlen oldatban tiol redukálószert és levegő oxidálást alkalmaznak. A részletek eléggé vázlatosak, és a kitermelést csak a kinyert termék aktivitására vonatkoztatják, mely 1-2%. Dixon azonban a Proc. Intern. Congr. Endecrinol. 2. kiadás, London, 1964, 1207- 1215 (1965) közleményében kissé részletesebben kifejtve arra utal (1211 oldal IV. táblázat), hogy a korábbi közlemény kísérleti körülményei külön redukciós és oxidációs műveletből állanak. Az előző módszerekkel szemben felismertük azt, hogy meghatározott körülmények között lehetséges az inzulin, vagy inzulin analógok kedvező szintű termelése S-szulfonált A- és B-láncból olyan eljárással, melyben mind a redukció, mind az oxidáció reakcióját egyetlen i nívelettel, egy oldatban folytatjuk le. Ez az az eljárás, melyre a találmány vonatkozik. Következésképpen, a találmány tárgya eljárás inzulin \agy inzulin analóg A-láncának és inzulin vagy inzulin rnalóg B-láncának egyesítésével inzulin vagy inzulin cnalóg előállítására oly módon, hogy az A-lánc S-szulfonált származékát, a B-lánc S-szulfonált származékát vizes közegben — 8—12 pH-értéken,- 0,1-50 mg/ml összes proteinkoncentráció mellett, és az összes A- és B-lánc S-szulfonált származékában jelenlévő, egy -SSOj csoportra számítva 0,4-2,5 -SH- csoportot tartalmazó merkaptán jelenlétében reagáltatjuk, és az eiegyet 0 cC és 25 °C közötti hőmérsékleten, levegő, mint oxigénforrás vagy oxigén jelenlétében 'ártjuk. A találmány tárgya jó kitermelésű, egyműveletes eljárás inzulin vagy inzulin analóg előállítására A- és B-lánc S-szül fonát-szá rmazékokból. Az „inzulin” kifejezés alatt természetesen bármelyik természetben előforduló inzulint értünk, mint amilyen az emberi szarvasmarha, sertés, juh, hal, madár és hasonló, valamint az egyik fajta A-lánc, és másik fajta B- ánc kombinációjával képzett hibrid inzulin. Az „inzulin analóg” kifejezés a proteinek bármilyen széles változatára vonatkozik, melyek mindegyike, a természetes inzulinokkal megegyezésben, a fél-cisztin maradékot szekvenciális sorozatban tartalmazó A-láncból és B-láncból állnak. Az analógok a természetes inzulintól egy vagy több aminosavmaradék szubsztitúciójában, addíciójában, elhagyásában, vagy módosításában különbözik, megtartva a diszulfidketés elrendezését és az inzulinhoz hasonló aktivitás legalább egy részét. Ilyen analógok például az [N-formii-Gly1-AJinzulin, dezamino- A'-inzulin, [szarkozin1-AJinzulin, IL-alaninUAJinzulin, [D-alanin1-AJinzulin, [izoaszparagin21 -AJinzulin, [D-aszparagin21-A]ínzulin, [arginin21-AJinzulin, [aszparaginamid21-AJinzulin, [szarkozin1-A, aszparagin21 -AJinzulin, [norleucin2-AJinzulin, [treonin5-A]inzulin, [lcucins-A]- inzulín, [fenil-alanin19-A] inzulin, [D-tirozin19-A]inzulin, [tirozinls-A, aszparagin19-A, arginin21-AJinzulin, dez[B23~so-tripeptid]inzulin, dez[B27’’30-tetrapeptid]inzulin, dez[B26’30-pentapeptid]inzuiin, dez[Bí, 30-tetrapeptid, tirozin-amid26-B]inzulin, des[B26 - 30-pentapeptid, fenilalanin-amid25-B]inzulin, des[B1‘’4-tetrapeptid]inzulin, desfB1'5-pentapeptidjinzulin, [lizin22-B]inzulin, [leucin9-B]inzulin, [leucin10-B]inzulin, desffenil-alaninLß]inzulin és hasonlók. Az irodalmak ilyen és más analógokat írnak le, például Blundell T. és munkatársai: Advances in Protein Chemistry, 26, 330—362, Academic Press, N.Y., N.Y. (1972); Katsoyannis P.G.: Treatment of Early Diabetes, 319-327, Plenum Publishing Corp. (1979); Geiger R.: Chemiker Zeitung, Reprint 100, 111-129, Dr. A. Hüthig, Publisher, Heidelberg, W. Germany (1976); Brandenburg, D. és mtsai: Biochem. J. 125, 51-52(1971). Bár a találmány szerinti eljárás széles körben alkalmazható inzulinok és inzulin analógok előállítására, azonban az eljárás főleg a természetben előforduló inzulinok, különösen az emberi, szarvasmarha vagy sertés inzulin, és legfőképp, emberi inzulin előállítására használható. A találmány szerinti eljárás lefolytatásában, az inzulin vagy inzulin analóg kialakításához az A- és B-lánc egyesí5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
