185416. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin- vagy inzulin analógok előállítására
1 185 4:6 2 tése, az egyik láncnak a másik lánchoz viszonyított igen változatos arányával történhet. Az egyesítést természetesen a kisebb mennyiségben jelen levő lánc, akár az A- lánc, vagy akár a B-lánc alapvetően meghatározza. Az A-láncnak B-lánchoz viszonyított szokásos aránya mintegy 0,1:1 és 10:1 közötti súlyarány. A találmány szerinti eljárás lefolytatásához az A-láncnak B-lánchoz viszonyított súlyaránya igen előnyösen 1:1 és 3:1 közötti tartomány. Továbbá azt is felismertük, hogy az előnyös határon belül, bizonyos tartomány különösen kedvező az inzulin különleges fajtáinak előállítására. Ilyen módon, a szarvasmarha inzulin előállításához az A- és B-lánc egyesítésében előnyös az, ha az A-láncnak B-lánchoz viszonyított aránya 1,4:1,0 és 1,8:1,0 között van. A sertésinzulinhoz előnyös tartomány az 1,0:1,0 és 1,4:1,0 közötti arány. Az emberi inzulinnál előnyös tartomány az 1,8:1,0 és 2,2:1,0 közötti arány. A találmány szerinti eljárás lefolytatásánál másik jellemző paraméter a reakcióelegy proteinkoncentrációjának optimális szintje. Az eljárás a proteinkoncentráció széles tartományával sikeresen lefolytatható. Általában, a reakcióelegy proteinkoncentrációja 0,1—50 mg/ml. Előnyösen, a proteinkoncentráció 2—20 mg/ml. Felismertük továbbá azt is, hogy ez utóbbi tartományon belül, az optimális proteinkoncentráció az előállított inzulin fajtájától függően változik. Következésképpen, scrtésinzulin esetén előnyös, ha a proteinkoncentráció 8-16 mg/ml. míg emberi vagy szarvasmarha-inzulin esetén az előnyös tartomány 3—8 mg/ml. A találmány szerinti eljárást vizes közegben folytatjuk le. A közeg szobahőmérsékleten mért pH-ja általában 8—12. Előnyösen, a reakcióelegy pH-ját 9,5 és 11,0, optimálisan 10,4 és 10,6 pH között tartjuk. A reakcióelegy pH-ját a kívánt tartományban erre alkalmas puffer hozzáadásával tartjuk. Ilyen jellemző puffer például a glicin, glicil-glicin, karbonát, trisz(hidroxi-metil)amino-metán, N,N-bisz(2-hidroxi-etil)-glicin, pirofoszfát, N-trisz(hidroxi-metil)-metil-3-amino-propánszulfonsav és más hasonló szerek, melyek az előbb említett tartományon belül a pH-t szabályozzák. Szokásos és előnyös puffer a glicin. A puffer koncentrációja általában 0,001-2 mól. Előnyös koncentráció a 0,01—1 mól, legelőnyösebben 0,01—0,1 mól. Az A- és B-láncokat egymással megfelelő vizes közegben, merkaptánok jelenlétében reagáltatjuk, melyek legalább egy szulfhidrilcsoportot tartalmaznak, valamint az A- és B-lánc S-szulfonát-csoportjainak hatásos redukálásához, megfelelő kapacitással rendelkeznek. Annak ellenére, hogy ilyen jellemzőkkel rendelkező szerek bármelyike alkalmazható, azonban legelőnyösebbek azok a tiol-redukálószerek, melyek oxidált formájukban igen stabil vegyületekké ciklizálódnak. A jelenlevő redukálószer mennyisége összesen 0,4-2,5 —SH csoport egy —SSO3 csoportra számítva, mely az A- és B-láncú S- szulfonát egész mennyiségében jelen van, és előnyösen mintegy 0,9-1,1 —SH csoport egy -SSO3 csoportra számítva. Jellemző inerkaptán például a ditiotreitol, ditioeritritol, 2-merkapto-etanol, metil-tioglikolát, 3-merkapto- 1.2-propándiol, 3-merkapto-propionsav, tioglikolsav és más ilyen tiolvegyület. Előnyös merkaptán a ditiotreitol és a ditioeritritol, legelőnyösebb azonban a ditiotreitol. A találmány szerinti eljárás egyik lényeges körülménye az, hogy az eljárást oxigén jelenlétében folytatjuk le. Ez a körülmény egyszerűen teljesíthető a reakcióelegy nyitott edényben levegőn történő kezelésével. Bár közvetlenebb érintkeztetési módszer is alkalmazható, mint például levegő vagy oxigén buborékoltatása a reakcióelegybe és a reakcióelegyen keresztül, ez azonban nem feltétlenül szükséges. Általában, a találmány szerinti eljárást az A-tánc S- szulfonát-származékát, a B-lánc S-szulfonát-származékát és a merkaptánt kívánt koncentrációban tartalmazó elegy elkészítésével vizes közegben, 8—12 pH tartományban folytatjuk le. Az elegyet, levegővel érintkeztetve, a láncegyesülés végbemeneteléhez elegendő ideig, általában legalább 30 percig, enyhén keverjük. A keverés ideje közben az elegyet általában 0°C és 25 °C közötti hőmérsékleten tartjuk; előnyösen azonban, az elegyet mérsékelten hűtve ezen tartomány alsó határánál, általában 2—10 °C hőmérsékleten tartjuk. Amint a reakció végbement, az inzulin vagy az inzulin analóg tennék a módszerek széles változatának bármelyikével elkülöníthető, melyek mindegyike az inzulin-technológia területéről ismert. Az inzulin tisztítására leginkább használt módszer a kromatográfiás technika. Ezek egyszerűen alkalmazhatók inzulin kinyerésére a találmány szerinti eljárásban. Ilyen technika a gélszűrés és az ioncserélő kromatográfla. Másfelől, a termék tisztasága és aktivitása ismert módszerekkel merhető. Ilyen például a poliakrilamid-gél elektroforézís, az aminosav-analízis, az inzulin radioreceptor-analízis, az inzulin radioímmun-analízis, a nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC), ultraibolya spektroszkópia, danzilezés, házinyúl vércukor vizsgálat, és hasonlók. Az inzulinok, melyek a találmány szerinti eljárásból kaphatók, magukba foglalják az egyik faj inzulin A-láncból, és a másik faj inzulin B-láncból álló hibrideket is. A találmány szerinti eljárás célja az A-és B-láncú S-szulfonátok megfelelő egyesítése, és ezen láncok részletes szerkezete - amennyiben ezek az inzulin vagy inzulin analóg A- és B-láncot hűen tükrözik - a találmány szerinti eljárás szempontjából nem lényegesek. Bár az inzulin, vagy egy inzulin hibrid, vagyis az egyik fajta A-lánc és egy másik fajta B-lánc egyesítése, a találmány szerinti eljárással előállítható, azonban természetesen, az A-láncú S-szulfonát és B-láncú S-szulfonát alkalmazásával, melyek mindegyike az ilyen inzulin rminösav-szekvenciáját tartalmazzák, előnyös olyan inzulin előállítása, mely szerkezetileg azonos a természetben előforduló inzulinnal. Következésképpen, a találmány szerinti eljárás alkalmazásával előnyös sertés, szarvasmarha vagy emberi inzulin, és legelőnyösebb emberi inzulin előállítása. Az inzulin, vagy inzulin analóg A- és B-láncok, mint már közöltük, DNS rekombinációs metodikával előállíthatok [lásd például R. E. Chance és munkatársai: Peptides: Synthesis-Structure, 1981 Pierce Chemical Co., 721-728], Ezek természetes inzulinból és klasszikus peptidszintezissei, beleértve vagy az oldal, vagy a szilárd Üízisú technikát, szintén előállíthatok. Az A- és B-láncokat stabil S-szulfonátok formájában tartjuk. Az S-szulfonát kiindulási anyagok oxidativ szulfitolízissel kaphatók, melyben az A- és B-láncokat nátrium-szulfittal, enyhe oxidálószer, mint nátriumtetrationát, jelenlétében reagáltatjuk. A találmány szerinti eljárás szemléltetésére a következő példákat adjuk meg. Ezek a példák csupán a talál-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
