185379. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új luteotróp releasing faktor monapeptid és dekapeptid származékainak előállítására

1

185 379

2

5. lépés

6. lépés

7. lépés

8. lépés

9. lépés

10. lépés

11. lépés

12. lépés

13. lépés

10% trietilamin/CH2Cl2

CH2C12 mosás N^-Boc-Aminosav oldat

N N'-diciklohexilkarbodiimid oldat CII2C12 öblítés és kötőkapcsolás

CH2C12-öblítő hozzáadás

CH2C12 mosás

etanol mosás CH2C12 mosás

kétszer

1,5 perc

háromszor

1,5 perc

egyszer

hozzáadása

egyszer

hozzáadása

egyszer

kapcsolási reakció 2 óra

egyszer

1,5

óra/perc

háromszor

1.5

óra/perc

háromszor

1,5 perc

háromszor

1,5 perc

40% 0,03 mólos ammónium-acetátot, és 60% acetonitrilt tartalmazó kifejlesztőszer) módszerrel ellenőrizzük az egyes frakciók tisztaságát, és az azonosakat egyesítjük.

5 A kívánt terméket az 1000 és 1400 ml közötti eluátum tartalmazza (Rf=0,l). A tiszta frakciókat egyesítjük, szárazra pároljuk, vízben felvesszük, majd liofilizáljuk, és így 57 mg tiszta piro-glutamil-hisztidil-triptofil-szeriltirozil-3-(2-naftil)-D-alanil-leucil-arginil-prolil-glicinamid 10 ecetsavas addíciós sóját kapjuk, [a]p = —27,4° (c = 0,9, ecetsav), op.: 185 — 193 °C (bomlik). Hasonlóképpen állítható elő a (piroj-Glu-His-TTp-Ser-Tyr-S-^-antrilj-DAla-Leu-Arg-Pro-Gly-NI^, melynek olvadáspontja 187— 195 °C; [ü]q = -16,9° (c = 1, AcOH).

Az 1-13. lépés egy aminosav kapcsolási ciklusát öleli fel, s a reakció teljes végbemenetelét E. Kaiser és társai [Anal. Biochem., 34, 595 (1970)] által ismertetett ninhidrines módszerrel ellenőrizzük.

A gyantához való kötést egymás után 2,5 mólos feleslegben vett aminosawal és DCC-vel végezzük. Ily módon a gyantát az egymás utáni kapcsolási ciklusokban a következő aminosavakkal kezeljük:

0,433 g Boc-Gly-Oíl,

0,432 g Boc-Pro-OH,

0,857 g Boc-Arg (tozil)-OH,

0,462 g Boc-Leu-OH,

0,504 g Boc-3-(2-nafti!)-D-alanin és 0,272 g 1-hidroxibenzotriazol,

0,724 g N-Boc,0-2-bróm-benzoiloxikarbonil-L tirozin, 0,59 g Boc-Ser-(benzil)-OH,

0,608 g Boc-Trp-OH,

0,654 g Boc-His(tozil)-OH és 0,524 g piroglutarpin sav. 35

A gyantát elkülönítjük a reakciótérből, CH2Cl2-vel mossuk, vákuumban szárítjuk, és így 2,0 g védett polipeptid-gyantát kapunk.

A polipeptid termékről egyidejűleg eltávolítjuk a gyantát, és a védőcsoportokat vízmentes cseppfolyós HE- 40 dal való kezeléssel a következő módon: 2,0 g védett polipeptid-gyanta és 2 ml anizol(derítő) keverékét Kel-F reakciós lombikban 20 ml CoF3-ról újradesztillált, vízmentes cseppfolyós HF-fel 0 °C-on 30 percen át kezeljük. Ezután a HF-t vákuumban lepároljuk, és maradékként (piro)-Ghi-His-Trp-Ber-Tyr-3-(2-naftil)-D-alanil-Leu- Arg-Pro-Gly-NH2 ■ HF sóját kapjuk, melyet éterrel mosunk. Az így kapott anyagot jégecettel extraháljuk, és az ecetsavas extraktumot liofilizálva 0,8 g nyersterméket kapunk.

A nyers polipeptidet 4X40 cm-es Amberlite XAD-4 típusú oszlopra (polisztirol — 4% divinil-benzo! kopolimer töltet) visszük, és víztől (0,5 1) etanol (1 1) felé haladó konkáv gradienssel eluáljuk.

A 690 és 1470 ml közötti eluátum frakciókat egyesítjük, vákuumban szárazra pároljuk, és így 490 mg részlegesen tisztított polipeptidet kapunk,

E részlegesen tisztított termék 150 mg-ját 3X50 cm-es Sephadex G-25 típusú oszlopon megoszlásos kromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 1,5% piridint tartalmazó 10:15 :12 :18 arányú 1-butanol/toluol/ecetsav/víz oldószer elegyet használunk. Vékonyrétegkromatográfiás (szilikagél; butanol : víz : ecetsav : etil-acetát =1:1 :1:1 arányú futtatószer) és nagynyomású folyadékkromatográfiás (5 mikronos, reverz fázisú, oktadecilszililtöltetű;

8

2. példa

C-terrninálisként Pro-NH-CH2CH3 részt tartalmazó 20 analógok szintézisét az 1. példában ismertetett szintézisprogrammal végezzük. A Beckman 990 Synthesizer reakcióterébe 2,13 g Boc-Pro-0-gyantát helyezünk, amelyet Boc-Pro-OH száraz cézium sójából klórrnetilpolisztirol/1 % divinilbenz.il (Láb System Inc.) gyantával 25 állítunk elő. Az alkalmazott Boc-Pro-0-gyanta mennyisége 1,4 mmól prolint tartalmaz.

A gyantához való kötést nyomás után 2,5 mólos feleslegben vett aminosawal és CDD-vel végezzük. Ily módon a gyantát az egymás utáni kapcsolási ciklusokban a követ- 30 kező aminosavakkal kezeljük:

1.61 g Boc-Arg(tozil)—OH,

0,93 g Boc-Leu-OH H20,

0,94 g Boc-3-(2-naftil)-D-alanin és 0,49 g 1-hidroxibenzotriazol.

A szintézis ezen fázisában a védett polipeptid-gyantát felében elhasítjuk, és egyik felét az alábbi aminosavakkal egymásután reagáltatjuk:

0,57 g Boc-Trp-OH,

0,77 g Boc-His-(tozil)—OH és 0,21 g piroglutamin sav.

A gyantát ezután elkülönítjük a reakciótérből, CII2C12 vei mossuk, vákuumban szárítjuk, és így 2,26 g védett polipeptid-gyantát kapunk. A védett polipeptidet a gyantáról 25 ml etil-aminnal 2 °C-on, 18 órán át vég- 45 zett aminolíziséve] távolítjuk el. Az etilamint hagyjuk eltávozni, és a gyantát metanollal extraháljuk. A metanolt lepároljuk, és így 1,39 g (piro)-Glu-His-(tozil)-Trp- Ser-(benzil)-Tyr-(2-bróm-benziloxikarbonil)-3-(2-naftil)D-a’anil-Leu-Arg-(tozil)-Pro-NH-CH2CH3 vegyületet ka- 50 púnk.

A nyers polipeptidről a védőcsoportokat 3 ml anizol és 30 ml CoF3-ró! újradesztillált vízmentes cseppfolyós HF elegyével 0 °C-on 30 perces kezeléssel Kel-F reakciós lombikban hasítjuk le. A HF-t vákuumban lepároljuk, és 55 a maradékot éterrel mossuk, majd 2 mólos ecetsavban feloldjuk. liofilizáljuk. így 0,82 g nyers (piro)-Glu-His-Trp- Ser-Tyr-3-(2-naftil)-D-alanin-Leu-Arg-Pro-NH—CH2CH3 ecetsavval képzett addíciós sóját kapjuk. 20 mg-os minta végső tisztítását nagynyomású folyadékkromato- 50 gráfiával 0,9X550 mm-es, 40-50 p-os oktadecilszililezett szüikagél töltetű oszlopon (Merck, Lichroprep C18) végezzük, eluálószerként 64% 0,03 mólos NH4oAc és 36% acetonitril tartalmú elegyet használunk. Négy futtatással kapott 61 mg nyersterméket tisztítunk. Há- 05 romszori liofilizálást követően 15 mg tiszta piroglutamil-