185379. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új luteotróp releasing faktor monapeptid és dekapeptid származékainak előállítására
1 185 379 2 elegyével készített oldatához 33,6 mg szubtilizin enzim 3 ml 0,1 mólos KCl-dal készített szuszpenzióját adjuk. A pH-t 0,2 mólos NaOH-dal végzett automatikus titrálással pH = 7 értéken tartjuk (pH radiometer segítségével). 30 perc alatt 70 ml NaOH oldat fogy, és ekkor a hidro- 5 lízist megállítjuk. Az oldatot 12 g NaHC03-mal bázikussá tesszük, és etil-acetáttal extrahdljuk. A szerves fázis metil- N-acetil-3-(2-naftil)-D-alaninátot tartalmaz. Etil-acetát hexán elegyből kristályosítva sárga szilárd anyagot kapunk, melynek op.-ja: 80-81 °C. 10 Az észter szabad aminosavvá, majd N-Boc aminosavvá az alábbiak szerint alakítjuk át: 2,5 g metil-N-acetil-3-(2-naftil)-D-alaninát 60 ml 6 n sósavval készített oldatát 3 órán át 120-130 °C-on melegítjük, majd szobahőmérsékletre hűtjük. A kivált fehér 15 csapadékot elkülönítjük, és 50 ml vízből — mely ammónium-hidroxiddal pH = 6-ra semlegesített 1 ml 12 n sósavat tartalmaz - átkristályosítunk, vákuumban szárítjuk, és így 3-(2-naftil)-D-alanint kapunk; op.: 242-244 °C, 20 [a]p = 26,6° (c = 0,5, CH3C02H). 3-(2-naftil)-D-alanin 55 ml 1 n NaOH 10 ml H20 és 20 ml dioxán elegyével készített oldatához keverés közben, 0 °C-on 1,48 g di-terc-butil-dikarbonátot és 0,22 g magnézium-oxidot adunk. 1,5 óra múlva további 0,3 g 25 di-terc-butil-dikarbonátot adunk a reakcióelegyhez, és szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni. A szilárd anyagot szűréssel elkülönítjük, és a szűrletet 50 ml térfogatra betöményítjük. E vizes oldat pH-ját NaHS04- gyel pH = 2,5-re álh'tjukbe,és etil-acetáttal extraháljuk. 30 A szerves fázist 5%-os nátrium-hidrogén-szulfáttal, vízzel és telített sóoldattal mossuk. . Az etil-acetátos fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, majd bepároljuk, és a kapott olajat éter és hexán elegyéből átkristályosítjuk. így 1,3 g N- 35 Boc-3-(2-naftil)-D-alanint kapunk, op.: 90-91 °C, [a]^ = -32,6° (c = 0,8, MeOH). A fenti módszerrel metil-N-acetil-3-(2-naftil)-D,L- alaninát helyett, azzal sztöchiometrikusan ekvivalens mennyiségű 40 metil-N-acetil-3-(l-naftil)-D L-alaninát, metil-N-acetil-3-(2-fluorenil)-D L-alaninát, metil-N-acetil-3-(2-antril)-D L-alaninát és metil-N-acetil-3-(2,2-difenil-metil)-D L-alaninátból kiindulva a megfelelő szabad aminosavakon keresztül a 45 következő N“-Boc-aminosavakat kapjuk: N-Boc-3-(l-naftil)-D-alanin,op.: 92-93 °C, [a]2D5 = 54,8° (c - 0,5, MeOH). N-Boc-3-(2-íluorenil)-D-alanin, op.: 161-163 °C (b), N-Boc-3-(2-antril)-D-a!anin és 50 N-Boc-3-(2,2-difenil-metil)-D-alanin, op.: 153—154 °C. 0,85 g 3-(2-naftil)-D-alanint, 100 ml 2 mólos sósavat és 0,85 g Adams katalizátort (Pt02) Parr-féle hidrogénező készülékbe helyezünk, 4,1 • 105 Pa 112 nyomáson 20 órán át hidrogénezzük. Ezután a reakcióelegyet a fehér csapadék oldódásáig melegítjük, és kovaföldön át- 6° szűrjük. Az oldatot vákuumban bepároljuk és liofilizálással víztelenítjük. így 0,8 g fehér színű, szilárd 3-(2-perhidro-naftil)-D-alanint kapunk, melynek olvadáspontja 230-232 °C. A kapott vegyületet 3,2 ml 1 n NaOH, 5 ml víz és 65 15 ml dioxán elegyében feloldjuk, és 0,14 g MgO-t és 0 85 g di-terc-butil-dikarbonátot adunk hozzá. A szuszpenziót 1 órán át 0 °C-on, és 2 órán át 25 °C-on állni hagyjuk, majd szűrjük, vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot vízben feloldjuk, dietil-éterrel mossuk,és pH-ját NaHS04-gyel pH = 2-re állítjuk be. A megsavanyított vizes fázist etil-acetáttal háromszor extraháljuk, az egyesített extraktumot MgS04-en szárítjuk, szűrjük, majd bepároljuk. így fehér olaj formájában 0,75 g N-Boc-3-(2-perhidro-naftil)-D-alanint kapunk. A fenti anyag 0.1 g-ját 5 ml tetrahidrofuránban feloldjuk, és 0 °C-on frissen készített diazometánnal kezeljük, amíg a világossárga szín megmarad. A reakcióelegyet 1 ml ecetsawal megbontjuk, az oldószert lepároljuk, és a maradékot 75 ml etil-acetát és 75 ml víz keverékével kezeljük. A szerves fázist 5%-os NaHC03-mal, vízzel, 5 %-os NaHS04-gyel, vízzel, telített NaCl oldattal mossuk, és MgS04-en szárítjuk. Szűrés és bepárlás után a maradékot preparatív vékonyrétegen (750 p vastagságú 20X20 cm-es szilikagél lemezen) kromatografáljuk. Kifejlesztőszerként diklór-metán-etil-acetát 18:1 arányú elegyét használjuk, és a kötött terméket eltávolítjuk. Ez utóbbit üvegszűrőn diklór-metán-etil-acetát 9:1 arányú clegyével mossuk, és a szűrletet vákuumben bepároljuk, így 0 1 g metil-N-Boc-3-(2-perhidro-naftil)-D-alaninátot halványsárga olajként kapunk. A kapott anyag a perhidro-naftalin gyűrű 2-es pozícióját sz ibsztituáló két izomer keveréke. E diasztereomer vegyireteket nagynyomású folyadék kromatográfiával Lichrosorb szilikagél 60, 5 mikronos oszlopon etil-acetáthexán 1:9 arányú eluálószerrel különíthetjük el, majd N-Boc-3-(2-perhidro-naftil)-D-alanin szabad aminosavvá hidroli/.álhatjuk. A fenti módszerrel 3-(2-naftil)-D-alanin helyett, azzal sztöchiometrikusan ekvivalens mennyiségű 3-( 1 -naftil)-D-alanin. 3-(2,2-difenil-metil)-D-alanin, 3 -( 2,4,6-t r imet il-fe nil)- D L-alanin, 3-(4-bifenilil)-D L-alanin, 3-(2,4,6-tri-(n-butil)-fenil)-D L-alanin és 3-(7,3,4,5,6-pentametil-fenil)-D L-alanin vegyületekből kiindulva a megfelelő N-Boc.-aminosavakat kapjuk: N-Boc-3-(l-perhidro-naftil)-D-alanin, N-Boc-3-(perhidro-2,2-difenil-metil)-D-alanin, N-Boc-3-(2,4,6-trimetil-cik]ohexil)-D L-alanin, N-Loc-3-(perhidro-4-bifenilil)-D L-alanin, N-Poc-3-(2,4.6-tri-(N-butil)-ciklohexil)-D L-alanin és N-L oc-3-(2,3,4,5,6-pentametil-ciklohexil)-D Lalanin. 1. példa Beckman 990 Peptide Synthesizer reakció terébe Rivaille fenti közleményében leírt benzhidrilamino-polisztirol divinilbenzol gyanta (Láb Systems, Inc.) 0,8 g-ját (0,8 mmól) helyezzük, majd a szintézis-programmal az amínosavakat a következő sorrendben adjuk a gyantához. 1. lépés CH2C12 mosás egyszer 1,5 perc 2. lépés 50%CF3CO2H/CH2Cl2-védőcsoport eltávolítás egyszer 1,5 perc 3. lépés 50% CF3C02H/CH2C12-védőcsoport eltávolítás egyszer 30 perc 4. lépés CH2C12 mosás háromszor 1,5 perc 7
