185315. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldható immunstimuláns glikoproteinak előállítására Klebsiella Pneumoniaeból
1 185 315 2 hatóanyagtól, a kezelt személytől és betegségtípusoktól függően - orális és rektális adagolás esetén naponta 1-15 mg, parenterális adagolás esetén pedig naponta 0,2-5 mg. A találmány szerinti glikoproteineket így gyógyászati kompozíciók hatóanyagaként használjuk. A hatóanyagokat az emésztőrendszeren keresztül, parenterálisan vagy lokálisan alkalmazhatjuk. Gyógyászati kompozíciókként például a humán gyógyászatban szokásos szilárd vagy folyékony kompozíciókat, például cukorral bevont vagy bevonat nélküli tablettákat, granulátumokat, oldatokat, szirupokat, kúpokat, injektálható, adott esetben liofilizált kompozíciókat, hüvelykúpokat, krémeket, cseppeket, kenőcsöket, lemosókat, szemcseppeket, aeroszolokat használunk, melyeket a szokásos módszerekkel készítünk el. A kompozíciókban töltőanyagként - melyet a hatóanyagodon kívül a kompozíció tartalmaz — a gyógyszertechnológiában szokásosan használt anyagokat, például talkumot, gumiarábikumot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, kakaóvajat, vizes és nem-vizes hordozóanyagokat, állati vagy növényi zsírokat, paraffinszármazékokat, glikolokat, különböző nedvesítő, diszpergáló vagy emulgeáló ágenseket, valamint tartósító szereket használunk. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg, közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. Példa A 2 171 907 sz. francia szabadalmi leírás 1. példája szerinti tennék 20 g-ját 2 1 ioncserélt vízben feloldjuk. Ezután 1,61 3%-os Cetavlont adunk lassan hozzá, és 1 órán át keverjük, majd 10 000 f/perc (rpm) fordulatszámmal 15 percen át centrifugáljuk. A csapadék eltávolítása után az elkülönített fclülú.szóhoz 15 perc alatt 31 95%-os alkoholt adunk. Ezután 1 órán át keverjük és 10 000 f/perc fordulatszámmal 15 percen át centrifugáljuk. Az így kapott felülúszót eltávolítjuk és a csapadékot 1 1 vízben feloldjuk, majd Visking csőben ioncserélt vízzel szemben 4 °C hőmérsékleten dializáljuk. A dialízis végén az oldatot liofilizáljuk. így 7,12 g várt terméket kapunk. A kapott termékjellemzői a következők: — neutrális áldozok: 57,77%. kénsavas rezorcinmódszerrel meghatározva (Tillmanns J. és Philippi K., Biochem. Z., 215, 36 (7, 16), 1929, módosította: Rimington, C. Biochem. .1., 25, 1062 (8) 1931); — aldózaminok: 1,75%, meghatározás módosított módszerrel (Elsőn L. A. és Morgan W. T. J., Biochem. J., 27, 1824(9, 15), 1933); — uronsavak: 6,83%, kénsavas karbazol módszerrel meghatározva (Dische, Z., J. Biol. Chem., 167, 189 (9, 15), 1947); — összetétel a glükózmaradékok alapján számítva: galaktóz 2,04, mannóz 0,61, glükóz 1. A meghatározást gázkromatográfiásán végeztük oly módon, hogy szilikonon meghatároztuk a trifluor-acctilezett metil-glikozidokat, melyeket úgy kaptunk, hogy a glikoproteineket metanolízisnek vetettünk alá 0,5 n metanolos sósavval, majd trifluor-acetileztíik trifluor-ecetsav és diklór-metán 1:1 arányú elegyével [Zanetta és munkatársai: J. Chromat. 69, 291 (1972)]; — molekulasúly ultracentrifugálással való becslés útján: 3 csúcs, ülepedési állandó: 0,94 -10 13 ± 5 %. 2. Példa A 2 171 907 sz. francia szabadalmi leírás 1. példa szerinti termék 20 g-ját 1 1 ioncserélt vízben feloldjuk. Ezután keverés közben 0,800 1 3 %-os Cetavlont adunk hozzá és 1 órán át keverjük, majd 10000 f/perc fordulatszámmal 15 percen át centrifugáljuk. A csapadék eltávolítása után az elkülönített felülúszóhoz 1,5 1 95%-os etanolt adunk és 1 órán át keverjük, majd 15 percen át 10 000 f/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A felülúszót elkülönítjük, és 0,5 1 vízben felvesszük a csapadékot. Ezután 4 °C hőmérsékleten ioncserélt vízzel szemben Visking csőben 48 órán át dializáljuk. A dialízis végén az oldatot liofilizáljuk, és így 6 g várt glikoproteint kapunk. 3. Példa Tabletta kompozíció előállítása — 1. példa szerinti glikoprotein 5 mg- töltőanyag 100 mg-os tabletta végsúly eléréséig (töltőanyagként laktózt, keményítőt, talkumot és magnézium-sztearátot használunk) 4. Példa Kenőcs kompozíció előállítása — 2. példa szerinti glikoproteinek 200 mg- töltőanyag 100 g-os végsúly eléréséig Farmakológiai rész A Immunstimuláns és mitogén hatás vizsgálata Tíz egérből álló csoportoknak állatonként intraplantárisan 40 pg vizsgálandó anyagot és 40 pg szarvasmarha szérum albumint adunk. Tíz nap múlva intravénásán letalitást és sokkot nem okozó dózisban (állatonként 100 pg-ot) szérum albumint adunk. A kontroll állatok az injekcióban csak szérum albumint kapnak. Az immunstimuláns hatást az anafilaktikus sokk válaszreakció növekedése alapján, a mitogén hatást az injekciós pontnál lévő ganglionkivezetések súlynövekedése alapján határozzuk meg. 1 mmunstimuláns hatás A szérum albumin intravénás beadása után 2 órával a pusztulások és a sokkos állapotban - melyet az orr cianóz.isával kísért nehéz légzés, a hátsó féltekék paralízise, konvulziók és pusztulás jellemez - lévő állatok számát meghatározzuk. Eredmények: A vegyület példaszáma A sokkos állatok száma (%) Pusztulások száma (%) 1 50 20 2 50 30 kontroll 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
