185314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új vízoldható immunstimuláns glikoproteinek előállítására klebsiella pneumoniae-ből
1 185 314 2 Sephadex géleket, előnyösen Sephacryl S 300-at, különösen előnyösen Ultragel ACA 34-t használunk. A szűrési művelet ellenőrzését a szokásos módszerekkel, előnyösen 238 nm-en végzett UV spektrometria segítségével végezhetjük. A találmány szerinti eljárást előnyösen az alábbi módon végezzük: — kvaterner-ammónium-sóként cetil-trimetil-ammónium-bromidot használunk: — a felülúszót centrifugálással különítjük el; — kis molekulasúlyú alkanolként etanolt; — gélként Ultragel ACA 34-t használunk; — az eiuált frakciót liofílizálással szárítjuk. A találmány szerinti glikoproteinek előnyös farmakológiái tulajdonságokkal rendelkeznek, így különösen kedvezőek immunstimuláns sajátságaik, valamint tolerabilitásuk. A továbbiakban a kísérleti részben ismertetett példákkal illusztráljuk azokat a farmakológiái tulajdonságokat, amelyek alapján a találmány szerinti glikoproteineket gyógyászati hatóanyagként használhatjuk. A találmány szerinti gyógyászati kompozíciókat, például humán és állatgyógyászatban baktériumok vagy vírusok által okozott infekciók megelőzésére, paraziták okozta megbetegedések, toxikus, valamint klinikai és sebészeti beavatkozásokat követő infekciók kezelésére használjuk. Az alkalmazott dózis a humán gyógyászatban — a hatóanyagtól, a kezelt személytől és betegségtípustól függően — orális és rektális adagolás esetén naponta 1—15 mg, parenterális adagolás esetén pedig naponta 0,25-5 mg. A találmány szerinti glikoproteineket így gyógyászati kompozíciók hatóanyagaként használhatjuk. A hatóanyagokat az emésztőrendszeren keresztül, parenterdlisan vagy lokálisan alkalmazhatjuk. Gyógyászati kompozíciókként például a humán gyógyászatban szokásos szilárd vagy folyékony kompozíciókat, például cukorral bevont vagy bevonat nélküli tablettákat, granulátumokat, oldatokat, szirupokat, kúpokat, injektálható, adott esetben liofilizált kompozíciókat, hüvelykúpokat, krémeket, cseppeket, kenőcsöket, íemosókat, szemcseppeket, aeroszolokat használunk, melyeket a szokásos módszerekkel készítünk el. A kompozíciókban töltőanyagként — melyet a hatóanyag (ok) on kívül a kompozíció tartalmaz — a gyógyszertechnológiában szokásosan használt anyagokat, például talkumot, gumiarábikumot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátct; kakaóvajat, vizes, nem-vizes hordozóanyagokat, állati vagy növényi zsírokat, paraffinszármazékokat, glikolokat, különböző nedvesítő, diszpergáló vagy emulgeáló ágenseket, valamint tartósító szereket használunk. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg közelebbről az oltalmi kör korlátozása nélkül. 1. Példa A 2 171 907 számú francia szabadalmi leírás 1. példája szerinti termék 20 g-ját 2 1 ioncserélt vízben feloldjuk. Ezután 1,61 3%-os Cetavlont adunk lassan hozzá, és 1 órán át keverjük, majd 10 000 f/perc (rpm) fordulatszámmal 15 percen át centrifugáljuk. A csapadék eltávolítása után az elkülönített felülúszóhoz 15 perc alatt 3 1 95 %-os alkoholt adunk. Ezután 1 órán át keverjük és 10 000 f/perc fordulatszámmal 15 percen át centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk és a csapadékot 1 1 vízben feloldjuk, majd 48 órán át ioncserélt vízzel szemben 4 °C hőmérsékleten Visking csőben dializáljuk, a végén pedig liofilizáijuk. így 6,2 g súlyú glikoproteint kapunk, és ebből 1 g-ot 10 ml 0,1 mólos ammónium-karbonátban feloldunk. Az oldatot 1 1 ACA 34 ultragélt tartalmazó 2,5 cm-es dializáló oszlopra visszük (eluensként 0,1 mólos ammóniumkarbonátot használunk), az első elúcíós csúcsnak megfelelő frakciókat egyesítjük (280 nm hullámhosszon UV-detektálást alkalmazunk), és liofilizáijuk. így 0,51 g várt tisztított glikoproteint kapunk. A kapott termékjellemzői a következők:- neutrális áldozok: 34%, kénsavas rezorcin-módszerrel meghatározva (Tilitnanns J. és Philippi K., Biochem. Z,, 215, 36 (7, 16), 1929, módosította: Rimington, C. Biochem. J., 25, 1062 (8), 1931);- aldózamínok: 3,1%, meghatározás módosított módszerrel (Elsőn L. A. és Morgan W. T. J., Biochem. J., 27, 1824(9, 15). 1933);- uronsavak: nyomokban, kénsavas karbazol módsz.errel meghatározva (Dische, Z., J. Biol. Chem., 167, 189 (9, 15), 1947);- összetétel a glükózmaradékok alapján számítva: galaktóz 4,00, mannóz 0, glükóz 1. A meghatározást gázkromatográfiásán végeztük oly módon, hogy szilikonon meghatároztuk a trifluor-acetilezett metil-glikozidokat, melyeket úgy kaptunk, hogy a glikoproteineket metanolízisnek vetettünk alá 0,5 n metanolos sósavval, majd trifluor-acetileztük trifluor-ecetsav és diklór-metán 1:1 arányú elegyéve! [Zanetta és munkatársai: .1. Chromat. 59, 291 (1972)];- molekulasúly ultracentrifugálással való becslés útján; 3 csúcs, üîepedési állandó: 17,5 • !0_!'±5%.- molekulatömeg: 350 000, meghatározás Yphantisféle módszerrel, a Chevenka által végzett módosítással: Biochemistry 3, 297 (1964) és Anal Biochem. 34, 24 (1970). 2. Példa A 2 171 907 sz. francia szabadalmi leírás 1. példája szerinti termék 20 g-ját I 1 ioncserélt vízben feloldjuk. Ezután keverés közben 0,8001 3%-os Cetavlont adunk hozzá, és 1 órán át keverjük, majd 10 000 f/perc fordulatszámmal 15 percen át centrifugáljuk. A csapadék eltávolítása után az elkülönített felülúszóhoz 1,5 1 95 %-os etanolt adunk és Î órán át keverjük, majd 15 percen át 10 007 f/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. A felülúszót elkülönítjük és 0,500 1 vízben felvesszük a csapadékot Ezután 4 °C hőmérsékleten ioncserélt vízzel szeml en Visking csőben 48 órán át dializáljuk. A dialízis végén az oldatot liofilizáijuk, és így 6,5 g súlyú várt glikoproteint kapunk, melyet ACA 34 ultragélen való átvezetéssel — az 1. példában ismertetett módon — tisztítunk. így 3,28 g súlyú várt glikoproteint kapunk. 3. Példa Tablelta kompozíció előállítása: — 1. példa szerinti glikoprotein 5 mg 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
