185314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új vízoldható immunstimuláns glikoproteinek előállítására klebsiella pneumoniae-ből
1 185 314 2 — töltőanyag 100 mg-os tabletta végsúly eléréséig (töltőanyagként laktózt, keményítőt, talkumot és magnézium-sztearátot használunk) 4. Példa Kenőcs kompozíció előállítása- 2. példa szerinti glikoproteinek 200 mg — töltőanyag 100 g-os végsúly eléréséig Farmakológiai rész A. Immunstimuláns és mitogén hatás vizsgálata Tíz egérből álló csoportoknak állatonként intraplantárisan 40 /rg vizsgálandó anyagot és 40 ug szarvasmarha szérum albumint adunk. Tíz nap múlva intravénásán letalitást és sokkot nem okozó dózisban (állatonként 100 jug-ot) szérum albumint adunk. A kontroll állatok az injekcióban csak szérum albumint kapnak. Az immunstimuláns hatást az anafilaktikus sokkválaszreakció növekedése alapján, a mitogén hatást az injekciós pontnál lévő ganglionkivezetések súlynövekedése alapján határozzuk meg. Immunstimuláns hatás: A szérum albumin intravénás beadása után 2 órával a pusztulások és a sokkos állapotban (melyet az orr cianózisával kísért nehéz légzés, a hátsó féltekék paralízise, konvulziók és pusztulás jellemez) lévő állatok számát meghatározzuk. Eredmények: A vegyület A sokkos állatok Pusztulások példaszáma száma (%) száma (%) 1 60 40 2 100 50 kontroll 0 0 Mitogén hatás; A szérum albumin intravénás beadása után 2 órával a túlélő állatokat leöljük és a térdhajlati ganglionokat — melyek az injekció helyénél a lábat kivezetik — eltávolítjuk és súlyukat megmérjük. A mitogénhatást a vizsgált vegyülettel kezelt állatok és a csak szérum albumint kapott kontroll állatok ganglionjai közepes súlyértékeinek arányával jellemezzük. Eredmények: A vegyület példaszáma 1 9,1 2 7,2 A kapott eredmények alapján az 1. és 2. példa szerinti vegyületek igen jó immunstimuláns és mitogén hatással rendelkeznek. B. A nem-specifikus védőrendszer stimulálása E hatást a Halpern által kidolgozott szén-clearence teszt alapján jellemezzük, mely szerint kolloid szén S2uszpenziót injektálunk az állat szemüregébe és az idő függvényében optikai sűrűség-méréssel a szén vérbe való bejutásának kinetikáját határozzuk meg. A vizsgált vegyületeket 24 és 48 órával a teszt előtt intraperitoneálisan adagoljuk. Az eredményeket a szénrészecskék eliminációjának százalékában adjuk meg, kontrollként a csak kolloidális szén részecskéket kapott állatok esetén a szénrészecskeszámot 100%-nak véve. Eredmények: Kontrolihoz viszonyított A vegyület Dózis hatás (%) példaszáma (mg/kg) 8 perccel az 30 perccel az injekció után injekció után 1 0,25 50 70 2 0,25 50 70 Fentiek alapján a szervezet védekezését a két vegyület stimulálja. C. Akut toxieitás Behrens és Karbe módszerével egereken intraperitoneális adagolással határozzuk meg az 50%-os pusztulást okozó dózis (LD50) értékeket. Áz 1. és 2. példa szerinti vegyületek esetén LDSo = = 30 mg/kg. D. Tolerancia Az 1. és 2. példa szerinti vegyületek 1000 y/kg dózisban való 0,2 ml-es szubkután injekciója egereken semmiféle helyi vagy általános intoleranciát nem okoz. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás 30-45% fehérjét, 30-40% neutrális aldózokat, kevesebb mint 4% glükuronsavat és 2—5% aldózaminokat tartalmazó, átlagosan 350 000 dalton molekulasúlyú, Klebsiella pneumoniae-ből extrahált vízoldható immunstimuláns glikoproteinek előállítására, azzal jellemezve, hogy Klebsiella pneumoniae kultúra Ijzátum extraktumának dialízist alkalmazó szűrésével kapott glikoprotein oldatát egy kvaterner ammonium vegyülettel kezeljük, a felülúszót - mely a glikoproteinsó oldata — a kapott csapadék elkülönítése után hidegen kis molekulasúlyú alkanollal kezeljük, és az így kapott csapadékot vízben ismét feloldjuk, dializáljuk, iiofilizáljuk, ezután ismét feloldjuk, gélen szüljük, az első elúciós frakciót összegyűjtjük, töményítjük és kívánt esetben megszárítjuk. (Elsőbbsége: 1980. szeptember 19.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy — kvaterner ammonium vegyületként cetil-trimetilammóniumbromidot használunk; — a felülúszót centrifugálással különítjük el; 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
