185314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új vízoldható immunstimuláns glikoproteinek előállítására klebsiella pneumoniae-ből
1 185 314 2 A találmány tárgya eljárás új vízoldható immunstimuláns glikoproteinek Klebsiella pneumoniae-ből történő előállítása. Klebsiella pneumoniae-ből kivont glikoproteineket néhány francia szabadalmi leírás, így pl. a 2 043 475, 2 088 112 és 2 171 907 számú ismertet. A találmány közelebbről 30—45% fehérjét, 30—40% neutrális aldózokat, kevesebb mint 4% glükuronsavat és 2—5 % aldózaminokat tartalmazó, kb. 350 000 dalton molekulasúlyú, Klebsiella pneumoniae-ből extrahált új vízoldható immunstimuláns glikoproteinek előállítására vonatkozik. Neutrális aldózokként előnyösen neutrális hexózokat, például glükózt, mannózt és galaktózt használunk. A találmány szerinti eljárással kapott glikoproteinek molekulasúlyát ultracentrifugálással határozzuk meg. A találmány szerinti glikoproteineket különböző Klebsiella pneumoniae törzsekből állíthatjuk elő, előnyösen a Pasteur Intézetben 52 145 számon letétbe helyezett törzset használjuk. E glikoproteinek szerkezetének vizsgálatát, összetételének meghatározását kémiai módszerekkel, előnyösen az uronsav-részek karbodiimides redukciójával, permetilezéssel, uronos-lebontással, perjódos oxidációval vagy króm-oxiddal végzett oxidációval végezzük. A találmány szerinti glikoproteinek poliszacharid frakcióhoz kapcsolódó fehérjeláncból állnak. A találmány szerinti előnyös glikoproteinek kb. 30 %ban savanyú aminosavat tartalmaznak. Savanyú aminosav kifejezés alatt pl. aszparaginsavat vagy glutaminsavat értünk. A találmány szerinti előnyös glikoproteinek poliszacharid frakciója 1 mól glükózra vonatkoztatottan kb. 4 mól galaktózt tartalmaz. Különösen előnyösek azok a glikoproteinek, amelyek az alábbi szerkezeti egységből felépülő poliszacharid frakciót tartalmaznak: j^3gaíaktóz1-j--—-galaktóz1-------—- glükóz1 j n ahol m jelentése olyan egész szám, melynek értéke 3, 4 vagy 5, n pedig olyan egész szám, melynek értéke 94 vagy attól kissé különböző, amennyiben m értéke 5. A találmány szerinti új vízoldható glikoproteineket olyan módon állítjuk elő, hogy 2 lizált Klebsiella pneumoniae kultúrák extraktumából dialízist alkahnazó szűréssel kapott glikoprotein oldatot egy kvaternerammónium-sóvál kezeljük, a felülúszó folyadékot a kivált anyagtól elkülönítjük, majd a felülúszót - mely a glikoproteinső oldata — hidegen egy kis molekulasúlyú alkanollal kezeljük. Az így kapott újonnan kivált anyagot vízben feloldjuk, dializáljuk, majd liofilizáljuk, ismét feloldjuk, gélen szűrjük, az eluátum első frakcióját elkülönítjük, betöményítjük, kívánt esetben szárazra pároljuk. Az eljárás kiindulási anyagaként különböző glikoprotein oldatokat használhatunk, amelyeket lizált Klebsiella pneumoniae kultúrákból egy bizonyos molekulasúlynak megfelelő vagy ennél nagyobb molekulasúlyú molekulák visszatartására képes kalibrált membránpórusokon (melyet a pórusállandóval jellemzőnk) történő dialízist alkalmazó szűréssel kapunk. Szűrőinembránként például a kereskedelemben kapható AMICON XM50, PM30 és UM2 típusokat, előnyösen a 100 000 dalton retenciós küszöbértékkel jellemez- 2 hetőeket, mint amilyen például az AMICON XM100 vagy H1P100 típusú, különösen előnyösen a 300 000 daltonnál nagyobb molekulasúlyú molekulák visszatartására képes típusokat, így pl. az AMICON és ROMICON XM300-zal kezdődő típus-sorozatokat használjuk. A megfelelő membrán kiválasztásával a dialízist alkalmazó szűrés folyamán az oldatban lévő, az adott molekulasúlynál nagyobb molekulasúlyú molekulákat — a kívánt retenciós küszöbérték függvényeként - elkülönítjük. Nyilvánvalóan az azonos minőségű más módszerekkel kapott — például polimerizált hidrofil gélen kromatografált — egyéb oldatok is megfelelőek. Az elkülönítési műveletet megelőzően előnyös, ha a zsírokat és nukleinsavakat eltávolítjuk. A kiindulási glikoprotein oldatokat előnyösen a 2 043 475 számú francia szabadalmi leíráshoz benyújtott 2 171 907 számú második pótszabadalmi bejelentés szerinti eljárás alapján kapjuk. E pótszabadalmi bejelentés szerint a glikoproteinek molekulasúlyát gélkiszoríiásos módszerrel határozzuk meg. Kvaterner-ammónium-sóként — mellyel a kiindulási glikoprotein oldatot kezeljük - például cetil-piridilammónium-kloridot, előnyösen trimetil-cetil-ammóniuinbromidot (Cetavlont) használunk. A kvaterner-ammónium-sóval végzett kezelést követően kapott csapadékot a felülúszótól szokásos módszerekkel, például dekantálással vagy szűréssel, előnyösen centrifugálással különítjük el. A felülúszót ezután hidegen, kb. 4 °C hőmérsékleten kis molekulasúiyú alkanollal, például metanollal, etanollal, n-propanollal vagy izopropanollal kezeljük. Előnyösen etanolt használunk. Különösen előnyösen egy térfogatrész sóoldatra vonatkoztatottan 4 °C hőmérsékleten éjjelen át hat térfogatrész etanollal végezzük a kezelést. A kivált anyagot vízben ismét feloldjuk, s tisztítás céljából dializáljuk. A dialízist pl. kollodium vagy cellulóz membránnal határolt standard dializáló egységgel végezzük. Előnyösen regenerált cellulóz membránú egységeket használunk, melynek közepes pórus átmérője kb. 24 Ä, és így a 12 000-14 000 daltonnál nagyobb molekulasúiyú anyagokat visszatartja, különösen előnyösen VISKING csöveket használunk. A dialízissel a giikoproteines oldatból a kis molekulasúlyú szennyezéseket, például az alkanoJ nyomokat távolítjuk el. A szárazra párolást a szokásos módszerekkel, például porlasztással vagy liofilizálással végezhetjük. A liofilizálást a szokásos módszerekkel, például közepes méretű fagyasztószublimáló berendezésben, például SMU vagy SMRG típusú készülékekben (Usifroid Co.) vagy nagyméretű liofilizátorokban, például CA1 fagyasztóban és SM1RS szublimálóban (Usifroid Co.) végezzük. Kisebb méretű, laboratóriumi készüléket, például Sérial Co. készülékeit, is használhatunk. A liofilizálást tetszés szerint alkalmazhatjuk, azonban alkalmazása előnyös. A gélszűrést vagy a liofilizátum vízben való feloldását követően, vagy pedig a glikoproteinek vizes oldatát használva végezzük. Előnyösen a szűrni kívánt oldatot pufferoljuk és az eluciót ugyanezzel a pufferrel hajtjuk végre, előnyösen pufferként ammónium-karbonátot használunk, olyan módon, hogy a szűrni kívánt glikoprotein oldat koncentrációja a pufferben 0,1 mólos legyen. Gélként például a kereskedelemben beszerezhető 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
