185312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminosav- és peptid származékok védőcsoportjainak eltávolítására cseppfolyós ammóniában fém nátriummal
I 185 312 2 keveréket a súlyának ötven-, százszoros mennyiségű kovasavgélen választottuk szét 100-200 ml • óra~' • kg-1 eluciós sebességgel. Megjegyezzük, hogy az oszlopkromatográfiás tisztítások során csak arra törekedtünk, hogy a melléktermékeket a szerkezetük meghatározásához megfelelő tisztaságban izoláljuk. Ezeket az elválasztásokat nem optimáltuk. A fajlagos optikai forgatóképesség mérése Perkin Elmer 141 számkijelzésü fotoelektromos polariméteren történt. . Az NMR-színképek Varian EM 360 műszerrel, TMS belső standard alkalmazásával készültek. A nagynyomású folyadékkromatográfiás méréseket Hewlett-Packard 1081 A típusú, Schöffel 770 változtatható hullámhosszú detektorral, Roadyne 7010 loop-injektorral és KUTESZ 185 típusú kétcsatornás írószerkezettel ellátott berendezésben végeztük. Az elválasztáshoz nucleosil 10 Cl8 (Chrom pack B. V.) 250 mm hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű töltetet használtunk. Az eluálást A : B = 4:6 eleggyel végeztük (A = metanol : acetonitril = 5 : l; B = pH 2,2-es Mcllvain pufferoldat tízszeresére hígítva, és nátrium-szulfáttal 0,1 mól/1 koncentrációjúra állítva); 500 p\ oxitocinoldatot fecskendeztünk a rendszerbe, és a mérést 1 ml/perc áramlási sebességgel végeztük, 210 nm-en detektálva az oldatok elnyelését. Kiértékelésre a külső standard módszert alkalmaztuk. Standardként tiszta oxitocint használtunk, amelynek biológiai aktivitását előzőleg meghatároztuk. A vékonyréteg-elektroforézist CAMAG (Unttem, Svájc) típusú készüléken, Moderey-Na Co. Polygram SIL G/UV254 kovasavgél lemezeken, 800 V feszültségen a következő pufferoidatokban végeztük: pH 1,9: 80 ml ecetsav+ 20 ml hangyasav+ 90 ml víz pH 4,3: 8 ml piridin +12 ml ecetsav+ 980 ml víz pH 6,5: 100 ml piridin+ 4 ml ecetsav+ 896 ml víz. Az elektroforetogramokat ninhidrinnel hívtuk elő. A védőcsoportot tartalmazó aminosav- és peptidszármazékok kezelését fémnátriummal cseppfolyós ammóniában a következőképpen végeztük. Egy 250 ml-es háromnyakú gömblombikba, amelyet etanolfürdőben szénsavhóval hűtünk, körülbelül 150 ml, fémnátriumról desztillált ammóniát csapunk le. Az ammóniagáz paraffinolajat tartalmazó gázmosón keresztül buborékoltatva desztillál el a lombikból. Ha a kellő mennyiségű ammónia összegyűlt, a gázbevezetést és a hűtést megszüntetjük, a mágneses keverést megindítjuk, és egy gumicsövön keresztül csatlakoztatott adagolókapszulából az előre kiméri és paraffinolaj alatt tarlóit fémnátriumból 1-2 mg-ot beejtünk az ammóniába, hogy vízmentességéről meggyőződjünk. A kísérleteket 5-10 mmól védett aminosav- vagy peptidszármazékkal végezzük. A továbbiakat 10 mmóios anyagmennyiségre közöljük. A kék ammóniaoldatba óvatosan beadagolunk 10 ml védett aminosav- vagy peptidszármazékot, majd 10 mg atomnyi részletekben a fémnátriumot. Ha a fémnátrium elreagált, vagy 15-20 percig kék maradt a reakcióelegy, beszórunk a beadagolt fémnátriummal egyenértékű mmólnyi ammóniumkloridot a nátriumsó(k) fölszabadítására és az esetleges nátriumfölösleg elreagáltatására. A kapott oldatot 20-30 °C-os fürdőben szárazra pároljuk. A maradékot 50-100 ml vízben, etanolban vagy a kettő elegyében oldjuk. Az oldat kémhatását tömény sósavval pH 3-7 közé állítjuk a további földolgozástól függően. 1. példa Az N-benziloxikarbonil-L-prolinamid redukciója. a) 5 mmol Z-Pro-NH2-ot 5 mg-atom fémnátriummal kezelve fehér szuszpenziót kapunk. A következő 5 mg-atom fémnátrium hatására a reakcióelegy 15 percen keresztül halványkék maradt. A reakcióelegyet a szokásos módon dolgozzuk fel. A maradékot 50 ml etanolban oldjuk, és az oldat kémhatását pH 7-re állítjuk. A vékonyrétegkromatogramon a várt H-Pro-NH2-on (Rj?: 0,55, R|: 0,95) kívül a prolin hidantoinszármazékát (Rj: 0,55, R’: 0,95) is kimutattuk. A kiindulási Z-Pro-NH2 (R^: 0,45) teljesen elreagált. b) 5 mmol Z-Pro-NH2 redukcióját 15 mg-atom fémnátriummal végezve nagyon heterogén elegyet kaptunk, mivel a hidantoinszármazék (Rj!: 0,90) további reakciókba lép a nátriummal, és több vegyület (Rf: 0,05-0,25) képződik. 2. példa Az N-terc-butiloxikarbonil-g!icinamid kezelése 10 mmol Boc-Gly-NH2-ot 10 mg-atom fémnátriummal reagáítatva fehér szuszpenziót kapunk. A földolgozáskor a maradékot vizben szuszpendáljuk, az elegy kémhatását pH 6-7-re állítjuk tömény sósavval, majd háromszor kloroformmal kirázzuk. A szerves fázist vákuumban bepároljuk. A maradékot éterben kristályosítjuk, így 1 mmol kiindulási Boc-Gly-NH2-ot (Rj: 0,35) nyerünk vissza. Az éteres szürletet vákuumban bepároljuk, és a maradékot éter-n-hexán (8 : 2) eleggyel oszlopkromatografáljuk. Az Rf: 0,70 kromatográfiás viselkedésű melléktermék (becsléssel a reakcióelegyben 20%) nem izolálható tiszta állapotban. A következő frakciókból 3,4 mmol N-terc-butil-oxikarbonil-etanol-amin (Rj!: 0,55) nyerhető ki. A pH 6-7-es vizes oldat elektroforetogramján (pH 6,5-ös pufferoldatban) 1 : 1 arányban H-Gly-NH2-ot és etanol-amint mutattunk ki. 3. példa Az N-terc-butiloxikarbonil-L-aszparagin kezelése a) 10 mmol Boc-Asn-OH-t 10 mg-atom fémnátriummal reagáítatva fehér szuszpenziót kapunk. Ennek feldolgozásakor a maradékot etanolban oldottuk, az oldat kémhatását pH 7-re állítottuk tömény sósavval, majd vákuumban szárazra pároltuk. Vízmentesítésére többször etanolt hajtottunk 10 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65 6
