185283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új foszforil-muramil-peptidek előállítására
1 2 185 283 leszterin = 4 1 ; 4 mg/állat) tengeriinalacokon egy késői típusú túlérzékenységet indukálnak BSA-val szemben. Ezek a késői típusú reakciók mind kvalitatív, mind kvantitatív szempontból azonosak az olyan reakciókkal, melyeket BSA-val történő im- 5 munizálásnál komplett Freund-adjuvánsban kapunk. Az EDjo-érték 100-300 pg/állat. Az (I) általános képletű új vegyületek a hidrofil muramildipeptidekhez képest további minőségi előnyöket mutatnak: 10 Balb/c egereket 1 x 104 P 815 masztocitóma-sejt - intraperitoneális injekciójával immunizáltunk a kísérlet 0. napján. A 15. napon az így immunizált állatok lépsejtjeit a P 815 masztocitóma sejtek ellen irányuló, cítotoxikus T-limfocitákra in vitro vizs- 15 gáijuk. Ez úgy történik, hogy a P 815 célsejteket 5 lCr-el jelöljük és a cítotoxikus reakció mértékét a tenyészetből kiálló részek radioaktivitásának mérése útján határozzuk meg. Az alkalmazott dózisban a P 815 masztocitómasejtek a kísérleti egerek szá- 20 mára szubimmunogének, vagyis a cítotoxikus T- sejtek képződését egyáltalán nem, vagy csak igen mérsékelten indukálják. Az említett (I) általános képletü muramil-peptideknek 1-50 pg mennyiségben történő egyidejű intraperitoneális alkalmazása 25 a cítotoxikus T-sejtek képződését szignifikánsan fokozza (a faktor 10-30 a kezeletlen egerekhez képest). Az (I) általános képletű új vegyületek immunpotenciáló tulajdonságai a transzplantációs antigé- 30 nekkel szembeni fajlagos immuntolerancia indukálásának esetében is kimutathatók egereken, adjuvált autoblasztokkal történő immunizálásnál. A leendő transzplantátum-befogadók (C57BI/6J egerek) lép-limfocitáit a leendő transzplantátum- 35 donorok (CBA/J egerek) besugárzott lépsejtjeivel vegyes limfocitatenyészetben inkubáljuk. Proliferálnak és olasztokká alakulnak azok a T-limfociták, melyek a donor hisztokompatibilitási antigénje számára specifikus receptorokkal rendelkeznek; 40 ezeket a többi sejttől ülepítés útján el lehet választani. A specifikus blaszlok exprimálják a membránreceptorok fontos idiotípusos fajlagosságait és azokat a prospektiv transzplantátum-befogadókba (C57BI/6J) - komplett Freund-adjuvánssal (CFA) 45 mint autoimmunogénnel adjuválva - befecskendezzük, a szóban forgó transzplantációs antigénekkel szembeni fajlagos tolerancia indukálása végett. Az immunizálást négy alkalommal végezzük, négy hetes időközökben, autológ anti-CBA/J T-limfo- 50 blasztokkal. A T-autoblasztoknak az (I) általános képletű új vegyületekkel alkotott adszorbátumai (109 blasztot 20 mg anyagnak 20 ml PBS-sel készített oldatába szuszpendálunk, majd 2 órás inkubálás után a sejteket centrifugáljuk és kétszer PBS-el 55 mossuk) képesek CFA távollétében specifikus immuntoleranciát indukálni, mimellett ezen adszorbátumok ugyanolyan hatásosak, mint a limfoblasztok CFA-ban. Az (1) általános képletü új vegyületek ezenkívül 60 normális egerek lépsejttenyészeteiben - 0,5-100 pg/ ml koncentrációban alkalmazva - az antitesteket termelő sejtek képződését indukálni képesek (a 19 S-plakk-képző sejtek szaporodásának faktora 10-30 a kontrolihoz képest [stimuláló anyagok tá- 65 vollétében]). így az említett vegyületek jelenlétében birkavörösvérsejtek elleni specifikus antitestek képződnek anélkül, hogy a tenyészethez birkavörösvérsejteket adnánk immunizálás végett. Másfelől a fent említett anyagok ugyanazon koncentráció-tartományban a T-sejtekben szegény lépsejttenyészetek (veleszületetten tímuszhiányos nu/nu egereké) immunológiai reakcióképességét is fokozni képesek egy normálisan timuszfüggő antigénnel (birkavörösvérsejt) szemben (a faktor értéke 10-30, a kezeletlen kontrollokhoz viszonyítva). Az említett vegyületek azonban közvetlenül vagy közvetve - in vitro - nemcsak a B-limfociták (vagyis a potenciálisan antitest-képző sejtek) proliferációs és szintézist eljesítményét indukálják, hanem a T-limfocítákra is hatással vannak (ezekhez tartoznak a szabályozó aktivitással rendelkező segítő- és szuprcs.szorsejtek, valamint a cítotoxikus effcktorsejtek). így az említett vegyületek 1-20 pg/ml koncentrációban alkalmazva kortizonrezisztens tímusz-sejtek azonos módon besugárzott stimulátorlimfocitákkal szembeni reakcióképességét jelentős mértékben (tízszeres értékig bezárólag) potencírozni képesek. A fentiekben említett hatások valószínűleg indirekt módon úgy jönnek létre, hogy ezek a foszforilmuramil-peptidek makrofágokat aktiválnak és ezel a T- és B-limfociták reakcióképességét növelik. Ténylegesen kimutatható, hogy a szóban forgó vegyületek már alacsony koncentrációban (0,5-10 pg/í) is nagymennyiségű „colony stimulating activity”-! (CSA) tesznek szabaddá egér-makrofágokból (150-200 telep indukálódik 7 napon belül, 10s egér-csontvelösejtből kiindulva, miután az anyaggal 24 óráig indukált makrofág-tenyészetből 20%nyit adtunk hozzá, míg kezeletlen makrofág-tenyészet hozzáadására csak 0-5 telep jön létre). A CSA egy biológiai közvetítő, amely a csontvelő-törzssejteknek a makrofágoktól és a polimorfmagvas leukoc itáktól való differenciálására szükséges. Az említett vegyületek ezáltal az olyan sejtek fokozott mé'tékü szaporodásának irányába hatnak, melyeknek igen nagy jelentőségük van a nem fajlagos ellenállóképesség, valamint a fajlagos (limfociták által közvetített) immunreakciók indukálására, amplifikációja és expressziója tekintetében. Az új vegyületek immunpotenciáló hatását in vivő is ki lehet mutatni. Eígy találmány szerinti nu ramilpeptid-foszfolipid-származék injekció 3-9 órán belül a szérum CSA-koncentrácíójának nagyfokú emelkedését eredményezi (120 telepig bezárólag 105 egér csontvelő-sejtenként, kloroformmal extrahált szérum [végkoncentráció = 5%] hozzáadása után; összehasonlításul: a kezeletlen állatoknál a telepek száma 0-5). Ennek megfelelően a szobán forgó vegyületek alkalmazása egerek antitestképző képességét in vivo jelentékenyen potencírozza. Az (I) általános képletü új vegyületek immunpoteiciáló tulajdonságait turnormodelleken, így pl. egerek Ehrlich-ascilesénél is ki lehet mutatni. Balb/c egereknek intraperitoneálisan injiciált 106 szingen Ehrlich-ascites daganatsejt átlag 18 nap alatt az állatok elhullásához vezet. Amennyiben az egerekbe intraperitoneális injekcióval 107 (1. cso3
