185264. lajstromszámú szabadalom • Javított mikrobiológiai eljárás androsztán szteroidok előállítására
1-185 264 2 ve 192 órás fermentációs tartammal. Az extraktumok elemzése azt mutatja, hogy 9o-OH-4AD célterméktartalmuk megfelelően 52 mg, illetve 98 mg. 3. példa A 2. példa szerint járunk el azzal az eltéréssel, hogy koleszterin szubsztrátum helyett nyers ßszitoszterint (ß-szitoszterin, kampeszterin és aszitoszterin 8:1:1 arányú elegye); ß-szitoszterin és kampeszterin 2 : 1 arányú elegyét; sztigmaszterint; koleszt-4-én-3-ont; koleszteril-oleátot; illetve 4BN-t alkalmazunk és a főfermentáció tartama 140 óra. A táptalajban képződött 9a-OH-4AD céltermék mennyiségeket a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat Sztcrol 9a-OH-4AD (mg) tojássárgája adalék van nincs Nyers a-szitoszterin 57 38 ß-szitosztcrin + kampeszterin 62 39 Szligmasztcrin 10 7 Koleszt-4-én-3-on 43 22 Koleszteril-oleát 5 4 4BN 12 6 4. példa 1,0% glükózt, 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont és a fennmaradó részben vizet tartalmazó oltó tápközeget (ph = 7,2) készítünk. Ebből az oltó tápközegből 100 ml mennyiséget töltünk 500 ml ürtartalmú rázólombikba. A lombikot és tartalmát autoklávban 15 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. A közeget oltókacsnyi mennyiségű M. parafortuitum komplex MCI-0801-el inokuláljuk, majd az inokulált közeget 48 órán át 30 °C hőmérsékleten vibrációs rázógépen inkubáljuk, percenként 120 (7 cm kitérésű) lökettel rázva a közeget. Tíz (10) darab 500 ml űrtartalmú rázólombik mindegyikébe 50-50 ml főfermentációs közeget (pH = 7,0) töltünk, melynek összetétele: 4,0% porított teljes 0,2% NaN03 szójabab 0,2% K2HP04 0,1 % MgS04 • 7H20 1,0% koleszterin a maradék víz A lombikokat és tartalmukat autoklávban 20 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. Mindegyik lombikot inokuláljuk a fentiek szerint kapott oltótenyészet 2 ml-nyi mennyiségével. Hasonlóképpen töltünk további tíz (10) darab 500 ml űrtartalmú rázólombikba egyező módon sterilizált főfermentációs közeget (pH = 7,0), mely az előbbitől abban tér el, hogy a felsorolt összetevőkön kívül 1,0%-ban szárított tojássárgáját is tartalmaz. A további tíz lombik mindegyikét ugyancsak 2-2 ml - egyező összetételű - oltótenyészettel inokuláljuk. A főfermentációt 30 'C hőmérsékleten, vibrációs rázógépen vezetjük le, percenként 120 (7 cm kitérésű) lökettel rázva a közeget, a fermentáció tartama 5-5 lombiknál 112 óra, 5-5 lombiknál 170 óra. Valamennyi lombik kombinált fermentlevét kétszer extraháljuk 1-1 liter etil-acetáttal. Az oldhatatlan közeget az extraktumokból leszűrjük, a szürlet ADD céltermék tartalmát gázkromatográfiával határozzuk meg. Az eredményt a 3. táblázat mutatja. 3. táblázat A képződött ADD mennyisége (g) ' inkubáció tartama (óra) tojássárgája adalék ~ -------112 170 Nincs 0,16 0,48 Van 0,47 0,61 5. példa 1,0% glükózt, 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont és a fennmaradó részben vizet tartalmazó oltó tápközeget (pH = 7,2) készítünk. Ebből az oltótápközegből 100 ml mennyiséget töltünk 500 ml ürtartalmú rázólombikba. A lombikot és tartalmát autoklávban 15 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. A közeget oltókacsnyi M. parafortuitum komplex MCI-0802-vel inokuláljuk, majd az inokulált közeget 48 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, vibrációs rázógépen percenként 120 (7 cm kitérésű) lökettel rázva a közeget. Főfermentációs táptalajt készítünk, melynek pH-ja 7,0 és azt autoklávban 20 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. A táptalaj összetétele: 2,0% porított teljes 2,0% élesztő szójabab 4,0% glicerol 0,2% NaNo3 0,2% K2HP04 0,1% MgS04 • 7H20 1,5% koleszterin a többi víz Egyenként 6 liter ürtartalmú rázólombikok közül két (2) rázólombikba a fenti összetételű főfermentációs táptalajból 800-800 ml-nyit töltünk, további két (2) rázólombikba olyan főfermentációs táptalajt töltünk, mely az előzőtől abban különbözik, hogy 1,5% tojássárgáját is tartalmaz. Mind a négy rázólombikba 20-20 ml fent leírt összetételű oltótenyészetet inokulálunk. A főfermentációt 30 "C hőmérsékleten vezetjük le, a közeget vibrációs rázógépen percenként 100 (7 cm kitérésű) lökettel rázva; csoportonként az egyik lombikban 130 órán át, a másik lombikban 180 órán át folytatjuk a fermentációt, majd az így kapott valamennyi fermentlevet egyenként 2,4 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumok ADD célterméktartalmát gázkromatográfiás elemzéssel határozzuk meg, az eredményt a 4. táblázat mutatja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
