185263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az immunszabályozást befolyásoló, TP5-analóg peptidek előállítására
1 185 263 2 Az 1. táblázat adatai mutatják, hogy a rheumatoid arthritis betegségben szenvedők limfocitáinak E-rozettaképző aktivitását szignifikánsan stimulálja az H-Arg-Lys-Asp-Val-OH tetrapeptid (2. sz. vegyület), ennek amidja (4. sz. vegyidet), a H-Arg- Lys-Asp-OH tripeptid (3. sz. vegyület), a H-Arg- Lys-Asu-Val-OH tetrapeptid (9. sz. vegyület) 10"9 mól/1 koncentrációban, valamint a H-Arg-Lys- Asp-Val-Ome tetrapeptidészter (5. sz. vegyület) 10'7 mól/1 koncentrációban. Szignifikánsan gátló hatást mutatott a piroglutaminsav-kezdetű penta- és tetrapeptid (6. és 7. sz. vegyületek) 10"9, illetve 10'5 mól/1 koncentrációban, valamint az aszparagint tartalmazó tetrapeptid (8. sz. vegyület) 10"5 mól/1 koncentrációban. A 2. táblázat adatai szerint az egészséges egyének limfocitáinak E-rozettaképző aktivitására szignifikáns stimuláló hatással bír a H-Arg-Lys-Asp-Val- OH tetrapeptid (2. sz. vegyület) 10"9 mól/1 koncentrációban, a H-Arg-Lys-Asp-OH tripeptid (3. sz. vegyület) 10'7 mól/1 koncentrációban. Ugyancsak stimuláló hatású a 2. sz. vegyület amidja (4. sz. vegyület) 10"11 mól/1 koncentrációban, valamint a H-Arg-Lys-Asp-Ala-OH tetrapeptid (5. sz. vegyület) és a H-Glp-Arg-Lys-Asp-ÓH tetrapeptid (7. sz. vegyület) 10"" mól/1 koncentrációban. Ebben a tesztben gátló hatású volt a 2. sz. vegyület metilésztere (7. sz. vegyület) 10"" mól/1 koncentrációban. Az antitest-termelésre gyakorolt, agglutinációs titerrel kifejezett in vivo hatást a 3. táblázat adatai mutatják. Eszerint szignifikánsan stimuláló hatású az Arg-Lys-Asp tripeptid 410"6 mó!/l koncentrációban; az Arg-Lys-Asp-Ala tetrapeptid 4-10“7 mól/1 koncentrációban, továbbá a H-Arg-Las- Asp~Val-NH2 4-10"8 mól/1 koncentrációban mutatott stimuláló hatást. Gátló hatást mutatott ebben a tesztben is a piroglutaminsavval kezdődő két peptid: a H-Glp-Arg-Lys-Asp-Val-OH 410"7 mól/1 és a H-Glp-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH 2T0"3 mól/1 koncentrációban. A plaque-képző lépsejtekre kifejtett in vivo hatás eredményeit a 4. táblázat tartalmazza. Eszerint a H-Arg-Lys-Asp-OH tripeptid, valamint a H-Arg- Lys-Asp-Val-NH2 tetrapeptidamid kisebb dózisaikban mintegy kétszeres növelést, a H-Arg-Lys- Asp-Ala-OH tetrapeptid pedig minden dózisban jelentős növelést mutatott. A találmány szerint előállított peptideket, valamint azok sóit a szokásos gyógyszerkészítmények alakjában használhatjuk fel a gyógyászatban. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerint vegyületeket enterális vagy parenierális beadásra alkalmas, szervetlen vagy szerves vivőanyag kíséretében tartalmazzák. A gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilizátumok, amelyekhez vivő anyagként peptidekkel nem reagáló vegyületeket, például szénhidrátokat alkalmazunk, lehelnek továbbá híg vagy tömény szuszpenziók vagy emulziók, de lehetnek tabletták vagy injekciók is, a szokásos kiszerelési formákban. A találmány szerinti eljárás foganatosítási módjait közelebbről az alábbi példákkal szemléltetjük. A példákban alkalmazott rövidítések a kémiai irodalomban használt rövidítéseknek felelnek meg (J. Biol. Chem. 247, 977 [1972]). További rövidítések: Z = benziloxikarbonil-, Boc = terc-butiloxikarbonil-, 0'Bu = terc-butiloxi-, OPfp = pentafluor-fenoxi-, Asu = L-2-amino-szukcinil-, OMe = metoxi-, OBzl = benziloxi-, ONB = 4-nitro-benziloxicsoport. Az olvadáspont-meghatározások dr. Tottoli-féle készülékben (Büchi, Svájc) történtek. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokat előre gyártott kovasavgél-adszorbensen (DC Fertigplatten, Merck) végeztük az alábbi oldószerelegyekben: 1 etil-acetát : (piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 : 11) = 95 : 5 2. etil-acetát : (piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 : 11) = 9 : 1 3. etil-acetát : (piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 : 11) = 4 : 1 4. etil-acetát : (piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 : 11 ) = 3 : 2 5. n-butanol : (piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 : 11) = 3 : 7 6. kloroform : metanol = 9 : 1 7. n-butanol : ecetsav : víz =1:1:1 8. n-butanol : ecetsav : víz = 4 : l : 5 felső fázisa. A kromatogramok előhívását ninhidrinnel, valamint klórozás után KJ-tolidinnel végeztük. A fajlagos optikai forgatóképesség mérése Perkin-Elmer 141 számkijelzésü fotoelektromos polariméteren történt. Valamennyi oldószer eltávolítását, illetve bepárlását Büchi-féle Rotavapor bepárlón végeztük 40 °C-nál nem magasabb hőmérsékletű vízfürdő alkalmazásával. 1. példa (A módszer) Z-Arg(N02)-Lys(Z)-Asp(OBzl)-Val-ONB 1,73 g (6 mmól) H-Val-ONB. HC1 15 ml dimetilformamidban készült oldatához 0,84 ml (6 mmól) trietil-amint és 2,45 g (5 mmól) Bos-Asp(OBzl)OPfp-t adunk. A reakcióelegyet 30 percig szobahőmérsékleten keverjük, az oldatot bepároljuk és a maradékot 30 ml etil-acetátban oldjuk. Az oldatot 15-15 ml 1 n sósavoldattal, 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd vízzel kirázzuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A maradékként kapott védett dipeptidet (Rf = 0,9) 10 ml 8 n sósavas dioxánban állni hagyjuk, majd 15 perc múlva az oldatot 40 ml vízmentes éterrel hígítjuk és szárazra pároljuk. A maradékként kapott szabad dipeptidet (R7 = 0,5) 10 ml dimelil-formamidban oldjuk, az oldat pH- értékét trietil-aminnal 8-ra állítjuk, és 3,1 g (5,5 mmól) Boc-Lys(Z)-OPfp-t adunk hozzá. A reakcióelegyet 30 percig szobahőmérsékleten keverjük, miközben az oldat pH-értékét trietil-aminnal 8-on tartjuk. Az oldatot ezután 60 mi kloroformmal hígítjuk, majd 15-15 ml n sósav-oldattal és vízzel kirázzuk. A szerves fázist szárítás után szárazra pároljuk és a maradékot vízmentes éterrel megszilárdítjuk. A kapott védett trieptidet (Rj = 0,4) 100 mi vízmentes éterrel kicsapjuk, leszűrjük és éterrel kétszer mossuk. A kapott terméket 20 ml dimetil-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
