185263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az immunszabályozást befolyásoló, TP5-analóg peptidek előállítására
1 185 263 2 ható katalitikus hidrogenolízissel. A kapott szabad peptidek az esetek többségében nem igényeinek további tisztítást. Egyes esetekben szilikagéloszlopkromatográfiás módszert is alkalmazhatunk a szabad peptidek tisztítására. Ilyenkor a végtermé- 5 két egyszerű bepárlással vagy liofilezéssel kapjuk meg. A kapott peptidek tetszőleges sóvá alakíthatók. A találmány szerinti új peptidek, valamint azok amidjai, észterei és gyógyászati szempontból elfő- 10 gadható sói - amint ez az alábbi biológiai vizsgálati. adatokból is kitűnik - az immunszabályozást eredményesen befolyásoló gyógyszer-hatóanyagok. E peptideknek a fentebb felsorolt védőcsoportokat tartalmazó védett származékai gyógyászati alkal- 15 mazásra önmagukban nem jönnek tekintetbe, de értékes közbenső termékek gyógyhatású peptidek előállítására. __________ A találmány szerinti eljárással készült peptidek biológiai vizsgálatát az alábbi módszerekkel végez- 20 tűk. I. In vitro módszer: az aktív E-rozetta vizsgálatot Wybran és munkatársai módosított módszere szerint (Wybran és munkatársai: New Engl. J. Med. 292, 475 [1975]) végeztük részben egészséges, rész- 25 ben autoimmun betegek (rheumatoid arthritis és szisztémás lupus erythematosus) limfocitáival. 50 jA limfocita-sejtszuszpenzióhoz 100 fi\ külön-külön hígított 10'3-10_I! mól/1 koncentrációjú vizsgálati anyagot adtunk, majd az elegyet 60 percig 5,0% 30 szén-dioxid-tartalmú levegőben 37 °C-on inkubáltuk. Ezután hozzáadtunk 50 /<l 1%-os birka-vörös- » vértest szuszpenziót, és percenként 1000 fordulatszámmal 10 percig centrifugáltuk, majd a módosított Gallenkampf-rázógépre helyeztük (rázási idő: 35 30 mp, lökethossz: 8 cm, rázási frekvencia: percenként 65). Ezután a rozettákat 0,1%-os glutáraldehiddel rögzítettük (csövenként 50 /il 3 perc). Mikroszkóp alatt megszámoltuk a három birka-vörösvértestnél többet megkötő limfocitákat, és négyszer 40 100 sejtet értékeltünk. A szeparált limfociták szennyezésként makrofágokat és polimorfonukleáris sejteket (maximálisan 10%-ot) tartalmaznak. Ezzel az értékkel a rozettát képző sejtek számát 45 Rheumatoid arthritises betegek limfoi minden esetben korrigáltuk. Az eredményeket az 1. és 2. táblázatban foglaltuk össze. II. In vivo módszer: ( 1 ) Az antitest-termelésre gyakorolt hatás vizsgálatát Ceglowski módszere szerint végeztük (Ceglowski: Ann. N. Y. Acad. Sei. 249, 343 [1975]). Újszülött H. Wistar patkányokat a születés után legfeljebb a 12. órában i. p. egyszeri 25 /A 410~3-4-I0~7 mól/1 töménységű vizsgálati anyaggal (dózisonként 9-9 állatot) kezeltünk. Ezután az állatokat 14 napos korukban birka-vörösvértest szuszpenzióval immunizáltuk (állatonként 0,5 ml 5%-os birka-vörösvértest szuszpenzió i. p.), és az immunizálást követő 7. napon az állatokat dekapitulációval elvéreztettük. 3-3 állat vérét összekevertük, és az ebből nyert savókból (percenként 3000 fordulattal történő, 10 perces centrifugálás után) meghatároztuk az antitesttitereket Takátsy módszerével (Takátsy: Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung. 3, 191 [1955]). Az eredményeket agglutinációs literben fejeztük ki. Titernek fogadtuk el azt a legnagyobb savóhígítást, amelynél még észlelhető az agglutináció. Az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. (2) A specifikus ellenanyagot termelő sejtek számának meghatározását Canningham módszere (Handbook of Experimental Immunology [szerkesztő: D. M. Weir] 2. kötet, 285. oldal, Blackwell, Oxford-London [1978]) sí:erint végeztük. A módszer lényege, hogy immunizált állatok lépsejtjeivel, birka-vörösvértest szuszpenzióval és komplementtel homogén szuszpenziót készítettünk és egysejtréteg kialakítására alkalmas kamrába helyeztük. Az ellenanyagot termelő lépsejtek körül litikus udvarok képződnek, melyek száma azonos a specifikus ellenanyagot termelő sejtek (plaque forming cells, PFC) számával. A kísérleti állatok legkésőbb 12 órával a születés után egyszeri i. p. kezelést kaptak a vizsgálandó anyagokból. Az (1) módszer szerint mindegyik anyagot 3 adagban vizsgáltunk meg. Az immunizálást követő 7. napon megvizsgáltuk az állatokból kinyert lépsejtek plaque-képzését. A kezelt és kezeletlen (kontroll) állatok plaque-képzésének hányadosát a 4. táblázatban adtuk meg. . ,. , _ 1. táblázat itainak E-rozettakepzo aktivitása* kontroll 10_,í Dózisok (mól/1) 10-9 !0 ? 10-5 10~3 1. H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH (TP5) 23,6 26,7 26,8 29,9 26,7 — 2. H-Arg-Lys-Asp-Val-OH 29,4 32,6 36,8 34,4 31,5 36,2 3. H-Arg-Lys-Asp-OH** 26,4 28,4 30,7 28.8 28,6 27,2 4. H-Arg-Lys-Asp-Val-NH, 26,4 28,2 34,8 26,9 29,8 31,5 5. H-Arg-Lys-Asp-Val-OMe 26,4 26,5 27,9 32,4 30,8 31,2 6. H-Glp-Arg-Lys-Asp-Val 23.7 20,4 19,4 21,4 23,2 22,8 7. H-Glp-Arg-Lys-Asp-OH** 23,7 18,4 19,7 19,5 18,7 20,6 8. H-Arg-Lys-Asn-Val-OH 27,7 24,3 23,7 24,6 21,9 22,3 9. H-Arg-Lys-Asu-Val-OH 20,8 25,0 28,6 24,3 22,5 23,6 10. H-Arg-Lys-Ala-Val-OH 20,8 23,1 25,5 21,7 23,4 20,3 11. H-Arg-Lys-Asp-Ala-OH 26,4 27,9 25,3 25,8 24.5 28,6 12. H-Arg-Lys-Asp-IIe-OH 27,7 24,5 28,7 23,2 25,4 25,5 13. H-Glp-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH 20,8 24,9 26,6 22,6 22,7 24,1 * Az aktív limfociták száma %-ban kifejezve (n = 4); ** P 0,05 F teszt (TP5-höz viszonyítva 1. szempontos vadancia-analízissel); P 0,005 Student t teszttel
