185223. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sztreptokináz és plazminogén biner komplexét tartalmazó enzimszármazék előállítására
1 i 85 223 2 megelőzésére vagy gyógykezelésére használhatók. Megelőzés céljaira olyan származékot célszerű használni, melynek hidrolízise lassú és ezért felezési ideje hosszú. Az e célra használható származékok hidrolízisének pszeudo-elsőrendü sebességi állandója 5 x 10-5 és 10“5 sec”1 közötti tartományba esik, és felezési ideje 3,5-16 óra. Gyógykezelés céljaira sokkal gyorsabban hidrolizáló származékok alkalmasak, azaz olyanok, amelyek pszeudo-elsőrendü sebességi állandója, 5 x 10”4 és 7 x 10”5 sec”1 közötti tartományba esik, amely kb. 30 perc-2 órás felezési. időnek felel meg. A pszeudo-elsőrendü sebességi állandót úgy határozzuk meg, hogy az enzimszármazékot fiziológiai körülmények között azaz izotóniás vizes oldatban, 7,4-es pH értéknél 37 °C-on elhidrolizáljuk. A reakcióelegyből szabályos időközökben aliquot részeket veszünk ki, melyeket valamely kromogén vagy fluorogén proteáz szubsztráttai pl. S-2251 -el (N-D-Val-Leu-Lys-p-nitro-anilid. 2HC1) indubálunk és a szubsztrát átalakulási sebességéi mérjük. A hidrolízist addig végezzük, amíg a fenti szubsztrát átalakulási sebessége maximumot ér el, A „k” sebességi állandói ezután úgy számítjuk ki, hogy az ln/i-A,(Amilx) értékeket a t függvényében ábrázoljuk. A képletben Am,„ az a maximális sebesség. amellyel a reakcióelegyből kivett aliquot rész a szubsztrátot átalakíthatja. At pedig az a sebesség, amellyel a t időpillanatban kivett aliquot részek alakítják át a szubsztrátot. A katalitikus helyek blokkolására alkalmas csoportok közé tartozik a benzoilcsoport és a szubsztituált benzoilcsoport. Bármelyik szubsztituált benzoilcsoporttal blokkolt enzimszármazék hidrolízisének pszeudo-elsőrendü sebességi állandóját kiszámíthatjuk az illető szubsztituens Hamett 5 értékének segítségével, ha két vagy több szubsztituált benzoilszármazék pszeudo-elsőrendü sebességi állandóját megmérjük, feltéve, hogy az enzim és az illető szubsztituens közöli nincs speciális kölcsönhatás. Általánosan elfogadott tény, hogy a méta- és para-helyzetü szubsztiluensek Hamett értékeiből (5m és 5p) a hidrolízis sebességét elfogadható pontossággal megbecsülhetjük, sőt a 5m és 8,, értékek összege az egynél több szubsztiluenst tartalmazó szubsztituált benzoil csoportok kinetikus sajátságainak kiszámítására is kielégítő pontossággal használható. Az orto-szubsztituensek Hamett értékei (50) nem összegezhetők a ) nem összegezhetők a 8n, és 8r értékeknél tapasztalt pontossággal térbeli effektusok miatt. Ha azonban az orlo-helyzetü szubsztituens kicsi és ezért a térbeli hatás elhanyagolható. például fiuormelil- és meloxi-származékok esetében, akkor a ö„ érték a hiba-határon belül lehet és akár egyedül, akár a 8m-el és/vagy Sp értékekkel összegezhető és igy a reakciósebesség számolható. A fenti korlátozások figyelembevételével az olyan szubsztituált benzoil-csoporl, amelyben a fenilgyürű egy- vagy több szubsztitucnst tartalmaz, különösen méta- és/vagy para-helyzetü szubsztiluensek esetében, ahol a Hamett 5 értékek összege + 0,1-- 1,1 közötti tartományba esik, alkalmasak Idők kolócsoport gyanánt a találmány szerinti eljárásban. Az alkalmas csoportok közül megemlítjük a benzoilcsoportol, az adott esetben halogénatommal, 1-4 szénatomszámú alkilcsoporttal, és/vagy 1—4 szénatomos alkoxi-csoporttal szubsztituált benzoilcsoportot. További példaként megemlítjük a paralluor-benzoilcsoportot, orto-, meta-, vagy paratoluoil-csoporlot, orto-, meta-, vagy para-metoxibenzoil-csoportot (azaz anizoilcsoportot) orto-, meta-, vagy para-etoxi-benzoilcsoportot, 4-butilbenzoil-csoportot. Ezen általános szabály alól kivétel, ha a benzoilcsoport valamely bázikus részt, például amino-, dimetil-amino- és guanidino csoportot tartalmaz. Az. ilyen származékok hidrolízisének sebességi állandója a számított értéknek csak tört része, esetenként l()-ed része lehet. A találmány szerinti származékot úgy állítjuk elő. hogy a sztreptokinázt valamely blokkolószer jelenlétében a plazminogcnnel elegyítjük. A blokkolószer általános képlete A-B vagy E-F, amelyben A olyan csoportot jelent, mely a fibrinbontó hatásért felelős katalitikus helyhez szelektíven kötődik és amely képes átmenni a B-csoporttól a katalitikus helyre, és B olyan iehasítható csoportot jelent, amely megkönnyíti az enzimnek az A- csoporlhoz történő kapcsolódását. E valamely lokalizáló csoport, mely a blokkolószert a katalitikus helyhez köti és F olyan csoportot jelent, mely a lokalizáló csoportról a katalitikus helyre képes átmenni. Az így képződött származékot azután adott esetben izoláljuk. Az A-B képletü szer használata a direkt blokkolás módszerét képviseli. Az ilyen reagensek általában ismertek. Egy példa a p-guanidino-benzoesavp-nitrofenil-észter. A guanidino-benzoil rész szelektíven kapcsolódik a katalitikus helyhez és ennek kapcsolódását a lehasadó para-nitrofenil-csoport elősegíti. Az E-F formájú szerek használata az inverz blokkolás módszerét képviseli. Az E képletü csoportra példaként megemlítjük a para-amidinofenoxi csoportot, és a para-acetil-amidino-fenoxi csoportot, vagy a strukturálisan hasonló helyzetű fenoxi csoportokat, melyek pozitív töltésű részt tartalmaznak, méta- vagy para-helyzetben. Az inverz blokkolórendszerekre példák az alábbiak: p-fiuor-benzoesav-p-amidino-fenil-észter, ptoluilsav-p-amidino-fenil-észter. p-metoxi-benzoesav-p-amidino-fenil-észter, benzoesav-p-amidinofenil-észter. 4-bulil-benzoesav-p-amidinofenilészter. 2.4-dimeloxi-benzoesav-p-amidino-fenilés/ter. 4-eloxi-benzoesav-p-amidino-fenil-észter, pmeloxi-benzoesav-p-acetil-amidino-fenil-észter, otoluilsav-p-amidino-fenil-észter, o-metoxi-benzoesav-p-amidino-fenil-észler, 3,4-dimetil-benzoesavp-amidino-fenil-észter. A direkt és inverz blokkoló reakciókat célszerűen pufferoll vizes közegben végezzük olyan pH- tartományban. amely sem az enzimre, sem a blokkolős/erre. sem pedig a termékre nem káros. A reakciót végezhetjük például 6 és 9-es pH-érték közölt, de célszerű 7-es pH közelében dolgozni. A reakciót általában úgy végezzük, hogy a blok5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
