185223. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sztreptokináz és plazminogén biner komplexét tartalmazó enzimszármazék előállítására
1 1X5 223 2 A találmány tárgya eljárás sztreptokináz és plazminogén aktivátor komplexét tartalmazó enzimszármazékok előállítására, melyek a vénás trombózis kezelésére használhatók. Ismeretes, hogy a sztreptokináz és a plazminogén enzim között létrejövő komplexek trombolitíkus szerként használhatók a vénás trombózis kezelésénél, A plazminogén egy béta-giobulin plazma, amely a fibrinbontó enzimnek, a plazminnak az inaktív prekurzora. A sztreptokináz a vörös vérsejt-oldó sztreptococcusok szekréciós terméke, mely nagy mennyiségben is olcsón előállítható. Ha a sztreptokinázt és plazminogént összekeverjük, kezdetben egy nagyon erősen, de nem kovalens kötéssel kötött binér komplex jön létre a kettő között. Ezután szerkezeti változás megy végbe a plazminogén komponensben, ami fehérjebontó hatással rendelkező katalitikus helyet lesz szabaddá. Ez a katalitikus hely azután felhasítja a peptid kötést először a sztreptokináz komponensben és másodszor a plazminogénben, amelyet plazminná alakit. A sztreptokináz és a plazminogén összekeverésekor keletkező végső komplex, melyei nem egészen precízen „sztreptokináz/plazminogén komplexnek” neveznek, tulajdonképpen a piazmin és a sztreptokináz hasadási terméke közt létrejött komplex. Jelenleg nem ismeretes olyan módszer, amelynek segítségével izolálni lehetne a kezdetben képződött, a sztreptokináz és a plazminogén között kialakult binér komplexet, amely katalitikus hellyel rendelkezik, mielőtt a belső pepiid kötés hasadása végbemenne, mert ez a labilis komplex rögtön degradálódik. Az ilyen komplexek létezését azonban ki lehet mutatni, ha a katalitikus helyet blokkolják úgy, hogy a sztreptokinázt és a plazminogént p-guanidin-benzoesav-p-nitrofenil-észter, mint acilezőszer jelenlétében keverik össze. (Lásd: D. K. McClintock és P. H. Bell, Biochem. Biophys. Res. Comm. 43 694-702. old. (1979.) A 79 301 773.2 számú európai szabadalmi bejelentésben olyan fibrinbontó enzimszármazékot írnak le, amelyben a fibrinbonlásért felelős katalitikus helyet blokkolják valamely csoporttal, amely bizonyos körülmények között hidrolízissel eltávolítható. Az itt leírt fibrinbontó enzimek egyike a sztreptokináz/plazminogén komplex. Minthogy ezt a komplexet úgy készítik, hogy először a sztreptokinázt és a plazminogént keverik össze, azután blokkolják a katalitikus helyet, a fenti szabadalmi bejelentésben leírt termék a „sztreptokináz/plazminogén komplex" blokkolt formája, azaz a már széthasított sztreptokináz és piazmin között kialakult komplex blokkolt formája. Azt találtuk, hogy a sztreptokináz és a plazminogén között kezdetben képződött binér komplexei is izolálhatjuk, ha e kettői feleslegben levő blokkolószer jelenlétében keverjük össze. Ez a komplex trombolitíkus szerként használható. Sőt ez sokkal homogénebb, sokkal hatásosabb és könnyebben elkészíthető, mint a 79 301773.2 számú európai szabadalmi bejelentésben leírt blokkolt „sztreptokináz/plazminogén komplex”. A találmány tárgya tehát olyan sztreptokináz és plazminogén binér komplexét tartalmazó enzimszármazék előállítására vonatkozó eljárás, amely komplexben a fibrinbontó hatásért felelős katalitikus hely olyan csoporttal van blokkolva, mely hidrolízissel eltávolítható, és a származék hidrolízisének pszeudo-elsörendű sebességi állandója 10'6 sec“1 és 10-3 sec'1 közötti, 7,4-es pH-jú izotóniás vizes oldatban 37 °C-on. Mint előbb említettük, a p-guanidin-benzoilcsoportot McClintock és Bell alkalmazta a sztreptokináz és plazminogén között kezdetben kialakuló komplex acilezésére. Itt azonban a kapott blokkolt származék csak a komplex aktív helyének titrálása aikalmával képződött. Továbbá, az eddigiek során néni történt említés arra vonatkozóan, hogy az ilyen blokkolt származékokat bárki izolálta volna, és arra sem, hogy azokat fibrinbontó szerként lehetne használni. A találmány tárgya továbbá eljárás olyan sztreptokináz és plazminogén binér komplexét tartalmazó enzimszármazék izolálására, amely komplexben a fibrinbontó hatásért felelős katalitikus hely olyan csoporttal van blokkolva, mely hidrolízissel eltávolítható, és a származék hidrolízisének pszeudo-elsőrendű sebességi állandója 10”6 sec“1 és 10~3 sec-1 közötti, 7,4-es pH-jú izotóniás vizes oldatban 37 °C-on. A találmány szerinti származék sztreptokináz komponense olyan természetes, nem hasított sztreptokináz, amelynek molekulasúlya kb. 47000. A korábban ismert „sztreptokináz/plazminogén komplex” olyan hasított sztreptokinázt tartalmaz, amelynek molekulasúlya kisebb mint 40000. A találmány szerinti eljárással előállított származékok jellemző vonása, hogy a nátrium-dodecílszulfát jelenlétében végzett redukció és elektroforeíikus bontás során, csak két polipeptid lánc detektálható, melyek közül az egyik olyan sztreptokináznak felel meg. melynek molekulasúlya kb. 47000, a másik pedig plazminogén. Ezzel szemben a korábban ismert „sztreptokináz/plazminogén komplex” az előbbihez hasonló analízis során legalább három polipeptid komponenst eredményez, melyek részben 40000-nél kisebb molekulasúlyú sztreptokinázhasadványnak és hosszú, illetve rövid piazmin láncoknak felelnek meg. A találmány szerinti származék előállítására bármely plazminogén, pl. emberi, macska, kutya vagy nyúl plazminogén használható, amely a sztreptokinázzal bimolekuláris komplexet képez. Célszerű azonban humán plazminogént használni. A találmány szerinti származék katalitikus helyének blokkolására lényegében olyan csoport használható. mely hidrolízissel eltávolítható és a hidrolízis pszeudo-elsörendű sebességi állandója nem kevesebb, mint 10'6 sec“' és nem nagyobb mint 10'3 sec-1. A sebességi állandó célszerűen 10 ”5—i0 _ 3 sec“1 közötti. Az olyan származékoknál, amelyek pszeudo-eisörendű sebességi állandója nagyobb mint 10"3 sec'1, elfogadhatatlanul sok szabad enzim keletkezik, mielőtt az a fibrinhez kapcsolódnék. Az olyan származékoknál pedig, melyek pszeudo-elsörendű sebességi állandója 10 6 sec 1 -nél kisebb, az enzim túl lassan szabadul fel ahhoz, hogy bármely klinikai használatra alkalmas lenne. A találmány szerinti származékok betegségek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
