184991. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin C antibiotikum előállítására új micromonospóra törzzsel
184991 II. táblázat Egyéb fiziológiai tulajdonságok Ceílulózbontás Nitrátredukció Tejbontás Nátrium-klorid tolerancia Növekedés burgonya szeleten Kalciumkarbonát nélkül KGO + + — 5 mm max. 3% nem nő ATCC 15835 + — 4 mm max. 3% nem nő ATCC 15836 + ++ — 6 mm max. 4% nem nő ATCC 15837 ++ — 7 mm max. 4% nem nő NRRL 2996 + + O O nem nő MNG 00122 + o.. o max. 3,5% o A fiziológiai-biokémiai, illetve a makro- és mikromorfológiai adatok áttekintése alapján a KGO jelzésű törzset a Micromonospora purpurea fajhoz tartozónak találtuk. Eltérések a Micromonospora purpurea ATCC 15835 és a KGO törzsek között: az autentikus Micromonospora purpurea törzs, az ATCC 15835 törzs erősen pozitív (+ -f- +) ribóz értékesítésével szemben a KGO törzs ribóz értékesítése csak nyomokban tapasztalható. Ezen kívül makromorfológiai adataink alapján a KGO jelzésű törzs vöröses, illetve olykor kissé lilás színű endopigmentjének intenzitása egyes táptalajokon gyérebb, mint a Micromonospora purpurea ATCC 15835 esetén, vagy néha a KGO törzsnél e pigment képzése teljesen hiányzik, és a kolóniák sárgásak vagy narancsszínűek. Vizsgálataink alapján tehát a KGO jelzésű törzset, mint a Micromonospora purpurea faj egyik alfaját különítettük el. Mikromorfológiai tulajdonságai alapján e ribóz-hasznosításra csak igen csekély mértékben képes törzsnek a Micromonospora purpurea ssp. luridus nevet adtuk. Kísérleteinkben a gentamicin antibiotikumot termelő új törzs, a Micromonospora purpurea ssp. luridus KGO termelőképességének növelésére a törzs tenyészetét mutagén behatás után speciális szelektív táptalajon szélesztve, nagyobb termelőképességű mutáns törzseket állítottunk elő. Mutagénként ultraibolya besugárzást, illetve nitrózóguanidint alkalmaztunk, de alkalmazhatunk a szakirodalomból ismert bármely mutagént, így például röntgen-sugárzást, gamma-sugárzást, nitrogénmustárokat, saíétromossavat stb. is. A speciális szelektív táptalaj szénforrásként laktózt és metil-béta-D-tio-galaktopiranozidot (MTGP) tartalmaz, összetételét alább részletezzük. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy ha a Micromonospora tenyészetünket a mutagén kezelés után a speciális táptalajon, aerob körülmények között, 22—45 °C-on inkubáljuk, akkor a kapott mutánsok között nagyobb számban izolálható olyan egyed, melynek gentamicin termelőképessége jelentősen megnő. Ezt a megfigyelést a következő táblázat szemlélteti. III. táblázat Izolált mutánsok száma Gentamicin termelőképesség a kiindulási törzs %~ában 85% 85— 115% 115— 130% 130% Mutagén kezelés, majd Czapek táptalajon szélesztés 248 12 227 9 Mutagén kezelés, laktóz+MTGP tartalmú táptalajon szélesztés 196 2 167 25 2 A speciális szelektív táptalaj összetétele laktóz 15 g káliumnitrát 1,5 g káliumdihidrogénfoszfát 1 g magnéziumszulfát 1 g kalciumklorid 0,5 g mangánszulfát 0,5 g vas(II)szulfát 0,02 g agar 15 g MTGP 0,1 g desztillált víz 1000 ml pH 7,0 A táptalaj elkészítéséhez a Czapek szilárd spóráztató táptalajt átalakítottuk: szacharóz helyett laktózt, és adalékként metil-béta-D-tio-galaktopiranozidot (MTGP) alkalmaztunk. Az ily módon átalakított táptalajon kifejlődött egyedek közül nagy számban voltunk képesek izolálni nagyobb termelőképességű törzset. A kísérleteink során izolált egyik ilyen mutánsnak, amely a gyors növekedése miatt ipari fermentációs szempontból a legelőnyösebb, a KGO—35 jelű Micromonospora purpurea ssp. luridus nevet adtuk. Ezt a gentamicin C-t termelő törzset az Országos Közegészségügyi Intézetben a Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében MNG—00209 szám alatt letétbe helyeztük 1981. október 15-én. Az új mutáns törzsek előnyös tulajdonságai közül — a magas gentamicin C termelőképesség mellett — kiemeljük, hogy a törzsek a gentamicin C antibiotikumokat a gyógyszerkönyvi előírásoknak megfelelő összetételben szintetizálják, a fermentlé gentamicin Cla tartalma 20—30%, gentamicin C2 tartalma 30— 40%, gentamicin C2a tartalma 5—15%, gentamicin C, tartalma 30—40%. Az új törzsek kedvező tulajdonságai közül megemlítjük még, hogy egyaránt jól hasznosítják a különböző ipari minőségű szénhidrátokat, így a kukoricalisztet, kukoricakeményítőt, búzalisztet, búzakeményítőt, szacharózt stb., továbbá nitrogén forrásként szójalisztet, mogyorólisztet, kukoricalekvárt, ammóniumszulfátot, ammóniumkloridot stb. A találmányunk szerint gentamicin C antibiotikum előállítására tehát úgy járunk el, hogy a Micromonospora purpurea mikroorganizmus fajhoz tartozó Micromonospora purpurea ssp. luridus KGO (MNG 00210) törzset, vagy mutagén behatás után szelektív táptalajon kiválasztott utódait, előnyösen a Micromonospora purpurea ssp. luridus KGO—35 (MNG 00209) törzset aszszimilálható szén- és nitrogénforrást, előnyösen szójalisztet és/vagy mogyorólisztet, kukoricakeményitőt és/ vagy búzakeményítőt, kukoricalekvárt, szacharózt, dextrint és ásványi sókat, előnyösen ammonium-, nátrium-, kalcium-, kobalt-sókat tartalmazó táptalajon, aerob körülmények között, 30—45 °C közötti, előnyösen 32—37 °C közötti hőmérsékleten tenyésztjük, majd a ke-15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
