184925. lajstromszámú szabadalom • Eljárás életképes sejtekké visszaalakuló streptomyces protoplasztok előállítására
I 184925 \ találmány tárgya új eljárás jó hatásfokkal élő sejickké alakuló Streptomyccs protoplasztok és az életképes sejtek előállítására. Hibrid sejtek előállítására több cukariota sejtrendszerben használatos a sejtfúziós módszer. A prokariota mikroorganizmusok genetikai információcseréje sejtfúziós módszert először Schaeffer és munkatársai cs Fodor cs Alföldi dolgoztak ki, ami a protoplasztok fúzióiából és sejtregenerálásából áll ; kísérleteiket a prokariota Bacillus nemhez tartozó mikroorganizmusokkal védték (Schaeffer és munkatársai, Proc. Natl, Acad. Sei., 73, 2151—2155, 1976: és Fodor és Alföldi, Proc. Sail. Acad. Sei., 73, 2147—2150, 1976). Napjainkban fedezték fel, hogy a gazdasági szempontból jelentős Streptomyces nemhez tartozó mikroorganizmusokkal elvégezhető a genetikai rekombinációval cgyüttjáró protoplaszt-fúzióval kiváltott genetikai információcsere (Baltz és Godfrey, „Method of Facilitating Genetic Exchange in Streptomyces by Protoplast Fusion" című szabadalmi leírás; Docket No. X -4830). A protoplasztok fúziójával létrehozott genetikai információcsere vagy genetikai rekombináció folyamatának fontos lépése az, amikor a fuzionált protoplasztokból életképes sejteket regenerálunk. A Bacillus nembe sorolt mikroorganizmusok fuzionált protoplaszija.it az előzőleg különálló sejtekre körültekintően kidolgozott körülmények között alakították vissza életképes sejtekké. A micélialis növekedésű Streptomyces sejtek életképes sejtekké regenerálódni képes protoplasztjainak képződéséről azonban nagyon keveset tudunk. Okanishi és munkatársai (J. Gen. Microbiol.. 80, 389—400, 1974) úgy találták, hogy az exponenciális növekedési szakasz közepéről vett Streptomyces griseus és Streptomyccs venezuelae sejtekből lizozimmal és No. 2. jelű litikus enzimmel hipertóniás oldatban protoplasztok készíthetők, cs ezek a protoplasztok jó hatásfokkal életképes sejtekké regenerálhatok. Úgy találták továbbá, hogy a stacioner növekedési fázisban levő sejtekből rosszul képződnek a protoplasztok. Okanishi és munkatársai eredményeivel ellentétben úgy találtuk, hogy azok a Streptomyces sejtek, amelyeket az exponenciális növekedési szakasz középső részén vizsgáltunk, igen gyengén alakulnak vissza, míg a klaszszikus exponenciális növekedési szakaszt követő és a stacioner növekedési szakaszt megelőző átmeneti fázisból vett sejtek igen jó hatásfokkal regenerálódnak. A találmány tárgya eljárás olyan Streptomyccs protoplasztok előállítására és az előállítás körülményeinek ismertetése, amely protoplasztok hatékonyan újraszir,tendálják sejtfalukat, és életképes sejtekké rcgcncrálódnak. A találmány szerinti eljárást alkalmazva a különböző Streptomyces törzsek között protoplaszt-fúzióval létrehozott különleges genetikai információcsere megúgyclésének valószínűsége megnő. A genetikai információcsere rc\cn növelhetők a gazdasági és terápiás szempontból fontos anyagcseretermékeket, például antibioükumokat termelő fajok változékonysága. Ezen lehetőig ipari alkalmazásai között felmerülhet nagymennyi- Í&Ü különleges metabolitot, például antibiotikumokat, rákellenes vegyületeket, enzimeket és más, használható 'újdonságokkal rendelkező mikrobiológiai termékeket szintetizáló törzsek előállítása, továbbá olyan hibrid laJok lét rchozása, amelyek új, értékes tulajdonságokkal rendelkező anyagcseretermékeket termelnek. 3 A találmány olyan eljárásra vonatkozik, amellyel jó hatásfokkal regenerálódó Streptomyces protoplasztokat állíthatunk elő. A találmány értelmében úgy járunk cl, hogy a Streptomyccs tenyészetet az exponenciális és a 5 stacioner (nyugvó) növekedési szakasz közötti átmeneti fázisig növesztjük, majd ezt követően protoplasztokat állítunk elő. Az átmeneti növekedési fázis a növekedési ciklusnak az a szakasza, ahol 1. a Streptomyces sejtek jó hatásfok- 10 kai alakulnak át protoplasztokká, és 2. az így kapott protoplasztok jó hatásfokkal regenerálódnak életképes sejtekké. A legelőnyösebb növekedési szakaszt a Streptomyces sejtek növekedési ciklusának megfigyelésével állapítjuk 15 meg. A növekedési ciklust bármely jól ismert módszerrel követhetjük. Végezhetjük a mérést glicint tartalmazó komplex táptalajban, zavarosságméréssel. A zavarosságméréskor az optikai sűrűségben (OD) bekövetkező változásokat határozzuk meg. Előnyösen a 600 nm hullám- 20 hosszúságú fény elnyelését (A 600) mérjük. A Streptomyces fajok oldódó komplex táptalajban alacsony sejtsűrűség mellett (A 600 kisebb mint 1,5) általában gyorsan felfutó exponenciális növekedési szakasszal rendelkeznek, amikor a sejtkétszereződési idő 25 1,5 óra és több óra közé esik. Amikor a sejtek növekedése eléri az 1,5—4,0 A 600 értéket, a sejtek a stacioner növekedési szakaszt megelőző átmeneti fázisba kerülnek. Az átmeneti szakasz 2—24 óra hosszú lehet, mialatt a sejttömeg 1,5—6-szorcsára nőhet, fajtától füg- 30 gően. Miközben a sejtek átlépnek a fenti növekedési szakaszba, olyan élettani változások következnek be, amelyek nagymértékben befolyásolják az életképes sejtekké visszaalakulni képes protoplaszt-képződést. A proto- 35 plasztokat általában hipertóniás oldatban állítjuk elő a micéliumok lizozimos kezelésével. Úg\ lalaltuk, hogy a korai exponenciális növekedési szakaszból (azaz A(l00: 0,05—0,2, egyes Strcptomycesck esetén 0,4-ig) származó sejtekből nem képezhetők jó ha- 40 tásfokkal protoplasztok. Ugyanakkor a Streptomyces fradice. esetén a korai exponenciális növekedési szakaszt követően létezik egy átmeneti fázis, amikor a sejtek protoplaszttá alakulnak, és ezek életképes sejtekké alakulnak vissza ; a Streptomyces fradiae sejtek például 600 45 nm hullámhosszon mérve 0,4 optikai sűrűségű tenyészetből elkülönítve protoplaszttá alakulnak, és a protoplasztok elég jó hatásfokkal élő sejtekké alakulnak viszsza. A sejteknek ez a regenerálódó képessége azonban gyorsan elveszik, mihelyt belépnek a közép-exponcn- 50 ciális növekedési fázisba. A közép-exponenciális növekedési szakaszban lévő sejtek 'Aeoo: 0,7—1,4) képeznek ugyan protoplasztokat, azonban ezek nem alakulnak vissza jó hatásfokkal clct- 55 képes sejtekké. Ahogy a sejtek bekerülnek a késői exponenciá'is növekedési fázisba, kezdik visszanyerni képességüket jó hatásfokkal regenerálódó protoplasztok képzésére. Végül, amikor belépnek az átmeneti növekedési fázisba (A600: 2,0—8,5), rendkívül alkalmassá válnak 60 olyan protoplasztok előállítására, amelyek azután jó hatásfokkal regenerálódnak sejtekké. A stacioner növekedési fázisba került sejtek regenerálódó képessége gyorsan csökken. Hasonló eredményeket kapunk a Streplomyces grisco- 65 fuscus és a Streptomyces aureofaciens törzsekkel, azzal 3
