184925. lajstromszámú szabadalom • Eljárás életképes sejtekké visszaalakuló streptomyces protoplasztok előállítására
5 184925 6 a különbséggel, hogy a stacioner növekedési szakaszt megelőző álmeneti fázis sokkal rövidebb. A találmány előnyös kivitelezési változata szerint ezért úgy járunk el, hogy a Strcptomyces sejteket a legelőnyösebb növekedési fázisig (az exponenciális és a stacioner növekedési szakasz között lévő átmeneti fázis) tenyésztjük, majd protoplasztokat készítünk a sejtekből, és ezeket megfelelő táptalajon szélcsztve életképes sejtekké alakítjuk vissza. A találmány szerinti eljárással, amelynek során a protoplasztokból megnövekedett hatásfokkal regenerálódnak a sejtek, a Strcptomyces nembe sorolt mikroorganizmusok között végbemenő genetikai információcsere és genetikai rekombináció megfigyelhetőségének valószínűsége fokozódik (lásd 4 és 5. példa). A találmány több Strcptomyces fajra vonatkozik. A későbbiekben az 1—3. példában az eljárást a Streptomyces griseofuscus és a Streptomyccs aurcofaciens törzseivel szemléltetjük. A találmány szerinti eljárással eddig egy Streptomyces nem regenerálódott sejtté, a Streptomyccs cinnamonensis törzs, amely glicinncl kiegészített komplex táptalajon tenyésztve erős autolitikus hatású vcgyülctct termel. A találmány szerinti eljárást előnyösen használhatjuk antibiotikumokat termelő Streptomyccs fajok protoplaszttá alakításakor. Különösen előnyösen használhatjuk az aminoglükozid-, makrolid-, B-laktám-, poliéter- és glikopep'.idlípusü antibiotikumokat termelő Strcptomyces fajokat. Aminoglükozid-típusű antibiotikumokat termelnek például a következő Streptomyccs fajok: S. kanamyceticus, S. chrestomyceticus, S. griseofiavus, S. microsporcus, S. ribosidificus, S. flavopersicus, S. spcctabilis, S. rimosus forma paromomycinus, S. fradiae var. ii.iticus, S. bluensis var. blucnsis, S. catenulac, S. olivcrcticuli var. cellulophilus, S. tenebrarius, S. lavendulae, S. albogriscolus, S. albus var. metamycinus, S. hygroscopicus var. sagamiensis, S. bikincnsis, S. griseus, S. erythrochromogcnes var. narutoensis, S. poolcnsis, S. galbus, S. rameus, S. olivaccus, S. mashuensis, S. hygroscopicus var. limoneus, S. rimofaciens, S. hygroscopicus forma globosus, S. fradiae, S. eurocidicus, S. aquacanus, S. crystallinus, S. noboritoensis, S. hygroscopicus, S. atrofaciens, S. kasugaspinus, S. kasugaeivis, S. netropsis, S. lividus, S. hafunensis és S. canus. A makrolid-típusú antibiotikumot termelő Strcptomyces fajok például a S. caelestis, S. piatensis, S. rochei var. volubilis, S. venezuelae, S. griseofuscus, S. narbonensis, S. fungicidicus, S. griscofaciens, S. roseocitreus, S. bruneogriscus, S. roseochromoeencs, S. cincrochromogenes, S. albus, S. felleus, S. rochei, S. violacconiger, S. griseus, S. maizeus, S. albus car. coilmyccticus. S. mycarofaciens, S. hygroscopicus, S. griseospiralis, S. lavendulae, S. rimosus, S. deltac, S. fungicidicus var. espinomyceticus, S. furdicidicus, S. ambofucicns, S. eurociducus, S. griseolus, S. flavochromogenes, S. fimbriatus, S. fasciculus, S. erythreus, S. antibioticus, S. olivochromogenes, S. spinichromogencs var. suragaoensis, S. kitasatoensis, S. narboncnsis var. josamyceticus, S. albogriseolus, S. bikiniensis, S. cirratus, S. djukartensis, S. curythcrmus, S. fradiae, S. goshikicnsis, S. griseofavus, S. halstcdii, S. tcndac, S. macrosporcus, S. tht rmotolcrans és a S. albireticuli. A [í-laklám-típusú antibiotikumokat termelő Strcp-lomyccs pl. a S. lipmanii, S. chvuligerus, S. Iactamdurans, S. griseus, S. hygroscopicus, S. wadayamensis ' S. chartreusis, S. hc-lcromorphus, S. panayaensis, S. cin. j namoensis, S. fimbriatus, S. halstcdii, S. rochei, S. viri. - dochromogcnes, S. cattleya, S. olivaceus, S. flavovirans S. fiavus, S. fulvoviridis, S. argenteolus és a S. sioyaensis. Poliéter-típusú antibiotikumot termel például a S. albus, S. hygroscopicus, S. griseus, S. conglobatus, s. eurocidicus var. asterocidicus, S. lasalicnsis, S. ribosidificus, S. cacaoi var. asocnsis, S. cinnamonensis, S. ' aureofaciens, S. gallinarius, S. longvvoodensis, S. fia- ' veelus, S. mutabilis és a S. violaceoniger. Glíkopcptid-tipusú antibiotikumokat termel például S. orientalis, S. haranomachiensis, S. candidus és a S. eburosporus. A találmány szerinti eljárást a következőkben példákkal részletesen szemléltetjük. I. példa Az alábbi összetételű tripticase-szója tápközegben : kazein pankrcáz-hidrolizátum (USP) 17,0 g szója pepton (L'SP) 3,0 g NaCl 5,0 g K2HP04 2,5 g dextrin 2,5 g víz 1 1-re pH = 7,3 (BBL Division of Becton Dickinson and Company, Cockeysviile, Maryland 21 030 gyártmány), amelyet 0,4% glicinncl egészítünk ki, 6—10 sejtosztódás eléréséig Strcptomyces fradiae törzset tenyésztünk. A glicin 0,4% koncentrációban az exponenciálisan növekvő sejtek generációs idejét 1,6 órától 2,7 órára növeli; magasabb glicin-konccntráció mellett a növekedés gátlása még fokozottabb. Az egyes növekedési szakaszokat 600 nm hullámhosszúságú fényben mérve az optikai zavarossággal (OD) határozzuk meg (Ab00, Baush cs Lomb típusú spektrofotométer). Az egyes növekedési fázisokban] lévő tenyészetekből mintákat veszünk. A sejteket homogenizáljuk, centrifugálás közben kétszer mossuk, majd P oldatban (Okanishi és munkatársai, J. Gen. Microbiol., SO, 389—400, 1974) szuszpendáljuk. 1— 2 mg/ml lizozimmcl kezeljük a sejteket, a kezelést P oldalban, 34. "C hőmérsékleten 1—2 órán át végezzük. 2— 3-szor centrifugálás közben mossuk az így kapott protoplasztokat, majd a P oldalban szuszpendáljuk őket. Ezután a P oldattal hígítjuk, és módosított R2 táptalajon (Okanishi és munkatársai, mint előbb) szélesztjük ; a módosított R2 táptalaj prolin helyeit aszparagint tartalmaz nitrogénforrásként. 34 CC hőmérsékleten 5—7 napon át inkubáljuk a tenyészeteket, majd a telepeket alkotó regenerálódott sejtek közel fele 5—7 nap alatt látható telepeket képez az R2 táptalajon. Kontrollként meghatározzuk az R2 hipertóniás táptalajon való szélesztés elölt desztillált sízzél hígított protoplasztokból és a 0,8% Nutrient tápközeget (Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48201) cs 4 mmol kalciumnitrátot tartalmazó hipotóniás táptalajon való szélesztés előtt hipertóniás puiïcrfu! (P) hígított protoplasztokból kifejlődött telepek számát ; a hipotóniás körülményeket az 1. táblázatban ismertetjük. Négy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
