184846. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homociromsav-oligoribozid-származékok előállítására

1

184 846

2

Co.) segítségével gélen szűrtük, melyhez eluensként vizet használtunk. 50 ml-es frakciókat gyűjtöttünk össze. A 11-15. frakciókat találtuk aktívaknak. Az egyesített aktív frakciókat (kitermelés: 72%) közvetlenül felvittük a DEAE-Sephadex A-25 oszlopra (HC03~ formára alakított; 400 ml; Pharmacia Co.), majd 0,1 M-tól 0,7 M-ig lineárisan növekvő koncentrációjú ammónium-hidrogénkarbonát oldattal eluáltuk. Aktív frakciókat körülbelül 0,25 M ammónium-hidrogén-karbonát mellett kaptunk. Az aktív frakciókat egyesítettük (kitermelés: 64%), majd az ammónium-hidrogén-karbonátot csökkentett nyomáson eltávolítottuk. Az így kapott koncentrátumot ezt követően felvittük a DEAE-Sephadex A-25 oszlopra (Cl" formára alakított; 200 ml; Pharmacia Co.), majd 0,01 M-tó! 0,5 M-ig lineárisan növekvő koncentrációjú nátrium-klorid oldattal eluáltuk.

Aktív frakciókat körülbelül 0,17 M nátrium-klorid koncentrációnál kaptunk (kitermelés: 58%). Az aktív frakciókat egyesítettük, betöményítettük 1 ml-re, majd egy hosszú Scphadex G-15 oszlop segítségével (30 ml) sómentcsítettük, melyhez eluensként vizet használtunk. A kevert oldószerrel (n-propanol és 3 M ammóniumhidroxid 70: 30 térfogatarányú elegyével) szilikagélcn végzett kromatografálás után (Silica AR CC-7, Mallinckrod Co.) fehér kristályokat kaptunk (80 mg;kitermelés: 49 %).

2. példa

A homocitromsav-oligoribozid-nátriumsó tulajdonságai

1. Fehér por; olvadáspont 205—210°C (bomlással).

2. Vízben oldható; szerves oldószerekben oldhatatlan.

3. A homocitromsav-oligoribozid hidrolízisével ribózokat és homocitromsavat kapunk.

5. Az UV-színképnek nincs maximuma.

6. Fenol/kénsavval és orcinol-hidrokloriddal pozitív színreakciót ad. Ninhidrinnel, Nelson-Somogyi reagenssel és difenil-amin/kénsawal negatív színreakciót ad.

5 7. A 13C NMR-színkép D20-ban az 1. ábrán látható.

8. Az ‘H NMR-színkép D2O-ban a 2. ábrán látható.

9. Az IR-színkép (KBr lemez) a 3. ábrán látható.

Ezek a tények azt jelzik, hogy a találmány szerinti homocitromsav-oligoribozid-származék az előzőkben ismertetett szerkezettel rendelkezik.

15 3. példa

Dextrán-szacharáz gátlása

A felhasznált dextrán-szacharázt az alábbi módon 20 állítottuk elő. Brain Heart Infusion húslét (Eiken Chemical Co.) beoltottunk Streptococcus ATCC 27607 mutánssal, majd egy éjszakán át tenyésztettük 37 °C-on. A tenyészet centrifugálással kapott szupernatáns folyadékát 50 %-osan telített ammónium-szulfáttal kicsaptuk. A ki- 25 csapott enzimet a szokásos eljárásokkal sómentesítettük és tisztítottuk.

A dextrán-szacharázra kifejtett inhibitorhatást az alábbi módon vizsgáltuk. A szubsztrátum oldat 2,7 ml-ét [0,3 % szacharóz, 0,04 % nátrium-azid, 30 mntól kálium- 30 klorid, 30 mmól nátrium-klorid, 50 mmól imidazol-HCl puffer (pH = 6,8)], a vizsgálati oldat vagy a kontroll esetén víz 0,3 ml-ét, valamint 50 mikroliter dextránszacharázt összekevertünk.

14 órás, 37 °C-on végzett inkubálás után vízhez viszo- 35 nyitva mértük a zavarosságot 600 nm-en. A százalékos gátlást a következő egyenlet szerint számítottuk:

(Kontroll zavarossaga)-(Vizsgalt oldat zavarossága)

Százalékos gátlás =-------------------------------------------------------------------X 100

(Kontroll zavarossaga)

4. Elemanalízis

3 C22 H.31 Oj9 LÍ3 .2H2 O

összegkép

letű vegyületre :

C [%]

H [%]

számított:

40,24

5,33

talált:

40,15

5,31

Ezen anyag egy egysége alatt azt a mennyiséget értjük, 45 amely 50 %-os gátlást idéz elő.

A 4. ábrán a homocitromsav-oligoribozid koncentrációja és a fenti eljárással meghatározott százalékos gátlás közötti összefüggés látható.

4