184736. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dagantellenes hatású immunglobulin-származékok előállítására
1 2 koncentrációnál 1,7-szer 10* -re, ami a kontrolinál mért értéknek csupán 5,5%-a. Ha a hibrid koncentrációja 5,1 Mg/ml volt, az élősejtek száma kisebb volt, mint 103, azaz kisebb, mint a kontroll 0,3%-a. Ha a szám kisebb, mint 103, nincs lehetőség az összeszámlálásra. Amint a 2. táblázat adatai mutatják, sem a. Fab’ fragmentum, sem az A fragmentum esetében nem volt megfigyelhető ilyen erős fitotoxicitás. U- gyanígy a Fab fragmentum és az A fragmentum ekvimoláris oldatainak elegye is alig fejtett ki hatást az élő sejtek számára, a kontrollal összehasonlítva. Ez azt mutatja, hogy a tumorellenes protein hibrid citotoxicitása nem a Fab és az A fragmentum egyszerű együttes hatásának tulajdonítható. 3. lépés DBA/2 Cr egerekbe hármas csoportokbanintraperitoneálisan 1-szer 104 L 1210 sejtet inokuáltunk. A következő napon a (c) lépésben leírt módon előállított tumorellenes protein hibrid előre meghatározott dózisát adagoltuk intraperitoneálisan, hogy megvizsgáljuk hatását az élettartamra. Az egerek kontroll csoportjának nem adtunk tumorellenes proteinhibridet. A kapott ereuményeket a 3. táblázatban foglaltuk össze. dózis ji/egér túlélési idő (%) 30,0 . 142 6,0 138 1,2 125 kontroll50 100 x valamennyi a kontroll csoportba tartozó egér 8 napon belül elpusztult. A 3. táblázat adataiból világosan látható, hogy az 1, 2, 6 és 30 jug/egér dózisban tumorellenes protein hibriddel kezelt egerek a kontroll csoporttal összehasonlítva (100%), 125, 138 és 142% túlélést mutattak, ami jelentős élettartam meghosszabodásnak fogadható el. Miután a (c) lépésben használt anti-L 1210 immunoglobulin nem abszorbeálódott az egerek egészséges sejtjein, tartalmaz egy olyan ellenanyagot, amely felismeri az egerek egészséges sejtjeit. így a toxicitás az egér gazdaállatokra is kifejtette hatását, és ezért a túlélés még akkor is csak 142%-ra növekedett, ha az egereket tumorellenes protein hibriddel kezeltük. Világos, hogy ha lejátszódna a fentemlített abszorpció, a találmány szerinti tumorellenes protein hibrid megnövekedett szelektív toxicitást mutatna a daganatsejtekkel szemben, és így javulna a gyógyhatás. Ha az anti-L 1210 ellenanyag adszorbedálódik a daganatsejteken vagy daganat antigéneken, a daganat-specifikus ellenanyag mennyisége nőhet, azonban, miután ez a folyamat nem lépett fel a mintában, feltételezzük, hogy az (a) lépésben kapott immunoglobulinban a daganat-specifikus ellenanyag mennyisége 1%-nál kisebb volt. Ennek megfelelően nyilvánvaló, hogy ha az említett adszorpciós eljárással több daganat-specifikus ellenanyagot tartalmazó immunoglobulint állítunk elő, és ezt használjuk a tumorellenes protein hibrid felhasználásához, kisebb dózissal nagyobb gyógyhatás érhető el. 2. példa (a) A tumorellenes immunoglobulin Fab’ fragmentumának előállítása 3 ml vizes konyhasó-oldathoz, amely 29 mg az 1. példa (a) lépése szerint előállított, L 1210 egér leukémia elleni nyúl ellenanyag (immunoglobulin IgG) Fab dirpeijét tartalmazta, 21 mg nátrium-szulfitot és 13 mg áátrium-tetrationátot adtunk, majd az elegyet 37 °C-on, egy órán keresztül S-szulfonatív hasításnak vetettük alá. így egy S-szulfo-csoportot tartalmazó Fab’ fragmentumot kaptunk, amely mellől a reagenseket dialízissel távolítottuk el. (b) A diftéria toxin A fragmentumának előállítása Az 1. példa (b) lépésben kapott egy szulfo gyököt tartalmazó diftéria toxin A fragmentum oldatának dialízisével előállított 4,8 mg/ml koncentrációjú A fragmentum oldat 1 ml-nyi mennyiségéhez 0,05 ml 0,5 mólos vizes 2-merkapto-etanolt adtunk. Az A fragmentum előállításánál a dialízist 0,01 mól TRIS. HcCl 0,14 mól nátrium-klorid és 2 mmól etilén-diamin-tetraecetsav 9,3 pH-értékű vizes oldatával szemben végeztük. Az elegyet 37 °C-on egy órán át redukáltuk. Ezután a 2-merkapto-etanolt dialízissel eltávolítottuk és így elkülönítettük az egy tiol-gyököt tartalmazó A fragmentumot. (c) 2 ml vizes oldatot állítottunkelő, amely 5,8 mg az (a) lépés szerint előállított Fab’ fragmentumot és 3,2 mg a (b) lépés szerint előállított A fragmentumot tartalmazott. A kapott oldatot 4 °C-on három napon át dializáltuk 0,05 mól glicin-puffer, 0,10 mól nátrium-klorid és 2 mmól etilén-diamin-tetraeacetát 9,15 pH-értékű vizes oldatának 1 liternyi mennyiségével szemben, hogy összekapcsoljuk a két fragmentumot. A reagáltatást követően az 1. példa szerint jártunk el, és így olyan protein hibridhez jutottunk, amelyben az A és Fab’ fragmentum egy diszulfid-kötés köti össze. 3. példa (a) Tumorellenes protein hibrid előállítása 5 mmól acetát puffer, 0,14 mól nátrium-klorid és 1 mmól etilén-diamin-tetraecetsav 5,5 pH-értékű vizes oldatának 1 ml-éhez, amely 36,8 mg, egy tiol-gyököt tartalmazó, az 1. példa (a) lépése szerint előállított anti-L 1210 immunoglobulin Fab’fragmentumot tartalmazott, hozzáadtuk -fenilén-dimaleimid (PDM) N,N-dimetil-fbrmamiddal készült, 20 mmólos oldatának 0,05 ml-nyi mennyiségét. Az elegyet 30 percen át 30 °C-on tartottuk. Ezután a reakcióelegyet 35 cm magas, 0,7 cm átmérőjű Sphadex G25 oszlopon gélszűrésnek vetettük alá, a reagensek eltávolítására 5 mmól ecetsav puffer, 0,14 mól nátrium-klorid és 1 mmól etilén-diamin-tetraecetsav (pH 5,5) elegyét használva. A diftéria toxin egy tiol gyököt tartalmazó A fragmentumának, a 2. példa (b) lépése szerint állítottunk elő, 2,15 mg/ml koncentrációjú vizes oldatából 1,0 ml-t hozzáadtunk az anti-L 1210 immunoglobulin PDM maradékát tartalmazó Fab’ fragmentum 4,29 mg/ml koncentrációjú vizes oldatának 1,04 ml-nyi mennyiségéhez, majd az elegyet egy éjszakán át 4 °C-on tartottuk. A reakcióelegyet ezután felvittük 93 cm hosszú, 1,6 cm átmérőjű Sphadex G150 superfine kromatográfiás oszlopra, az eluálást pedig 0,9%os vizes nátrium-klorid oldattal végeztük. A 38-42. frakciók összegyűjtésével olyan oldathoz jutottunk, amely 4,4 mg tumorellenes protein hibridet tartalmazott. Azt, hogy az említett frakciók valóban tumorellenes protein hibridet tartalmaztak, a következő módon igazoltuk. Az oszlopkromatográfiásan kapott 184.736 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
