184736. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dagantellenes hatású immunglobulin-származékok előállítására
1 2 különböző frakciók protein-koncentrációjának meghatározása érdekében megmértük 280 m/i hullámhosszon mutatott abszorpciójukat. Az így felvett görbe három csúcsot tartalmazott, amelyeket sorrendben 12. és 3. csúcsként jelölünk. A görbét az 5. ábra muiatja. A csúcsoknak megfelelő helyeken a proteineket Ouchterlony módszerével analizáltuk, tengeri malac nyúl-ellenes Fab’ ellenanyagát és ló diftéria-ellenes ellenanyagát használva. A kapott eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be. Az 1. és 2. csúcsoknak megfelelő proteinke a nyúl-ellenes Fab’ ellenanyaggal csapadékot képeztek, míg az 1. és 3. csúcsoknak megfelelő proteinek a diftériaellenes toxin ellenanyaggal adtak csapadékot. így világos, hogy az 1. csúcs Fab’ és A fragmentumot egyaránt tartalmaz. Az eluálási pontból az is megállapítható, hogy az 1. csúcsnak megfelelő protein molekulasúlya körülbelül 70,000 ami megfelel a Fab’ fragmentum 46000 körüli és az A fragmentum 24 0000 körüli molekulasúlya összegének. Az eredményekből levonható a következtetés, hogy az 1. csúcsnak megfelelő protein a találmány szerint tumorellenes hibrid, amely 1 molakula Fab’ fragmentumot és 1 molekula A fragmentumot tartalmaz, amelyeket PDM köt össze. A 2. illetve 3. csúcsokkal jelzett proteinek az el nem reagált Fab fragmentumnak és a diftéria toxin el nem reagált A fragmentumának felelnek meg, és lehetnek PDM-mel módosítottak vagy nem módosítottak. (b) A tr moreilenes protein hibrid citotoxicitásának mérése 3-szor 104 L-l 210 egér leukémia sejtet 5% szén-dioxidot tartalmazó levegőn, 37 °C-on 1,2, 3 illetve 4 napig tenyésztettünk, 1-1 ml RPMI táptalajban, amely 10% magzati borjúszérumot, 20 /imól 2-merkapto-etanolt és 100 /ug/ml kanamicin-szulfátot tartalmazott. Ezután 30, 6 illetve 1,2 /ug/ml végkoncentrációban hozzáadtuk az (a) lépés szerint előállított tumorellenes pritein hibridet. Az összehasonlítás kedvéért olyan táptalajban is tenyésztettünk L-l 210 sejteket, amelyhez 20 /ug/ml Fab’ fragmentumot és 10 /Jg/ml A fragmentumot adtunk (1:1 mólarányban), a tumorellenes protein hibrid helyett. Kontrollként L-l 210 sejteket tenyésztettünk azonos táptalajban, amely sem tumorellenes protein hibridet, sem Fab fragmentumot, sem a diftéria toxin A fragmentumát nem tartalmazta. A tenyésztés befejeztével pipetta segítségével a sejtek egységes szuszpenzióját készítettük el, majd megszíneztük 0,3%-os Trypan Biuefoszfát puffereit konyhasó-oldattal, és mikroszkóp alatt megszámoltuk az élő sejteket. Az eredményeket a 6. ábrán szemléltetjük. A 7. ábrából világosan látható, hogy a tumorellencs protein hibrid jelentős citotoxikus hatást fejt ki 30 és 6 /ug/ml koncentrációban. A hatás különösen jelentős volt a tenyésztés második napjától kezdve. Másrészt, a Fab fragmentum és a diftéria toxin A fragmentuma keveréke esetében (1:1 mólarány) egyáltalán nem lehetett citotoxicitást megfigyelni. Levonható tehát a következtetés, hogy ahhoz, hogy a toxicitás fellépjen, a két fragmentumnak feltétlenül kovalens kötéssel hibriddé kell összekapcsolódnia. 4. példa A 3. példa szerinti eljárással tumor-eljenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab’fragmentum és az A fragmentum összekapcsolása az N,N’-(1,3-fenilcn)-dimaleinimid térhálósító szer segítségével, a megfelelő kénatomokon keresztül történt. Az N,N - -(1,3-fenilén)-dimaleinimidet a 3. példában használt PDM helyett alkalmaztuk. 5. példa A 3. példa szerinti eljárással tumorellenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab fragmentum és az A fragmentum összekapcsolása a PDM helyett 4,4’-bisz(maleoil-amino)azobenzol térhálósító reagens segítségével történt, a megfelelő kénatomokon keresztül. 6. példa Az 1. példa (a) lépésben előállított anti-L 1210 immunoglobulin IgG Fab’ fragmentumot, amely egy tiol gyököt tartalmazott, feldoldottuk 3 térfogatrész 0,1 mólos nátrium-foszfát puffer (pH = 6,0) és 1 térfogatrész N,N-dimetil-formamid elegyében úgy, hogy 7 mg/ml koncentrációjú oldatot kapjunk. N,N -etilén-bisz(jód-acetanrid)térhálósító reagenst 6 ml/ml menynyiségben feloldottunk N,N-dimetil-formamidban. A reagáltatás szobahőmérsékleten, egy órányi végeztük úgy, hogy a fenti módon előállított Fab -oldat 1,0 ml-éhez 0,1 ml N,N’-etilén-bisz(jód-acetamid) oldatot csepegtettünk, majd a reakcióelegyhez 0,05 ml 0,07 mólos vizes 2-merkapto-etil-amin oldatot adtunk. Az elegyet szobahőmérsékleten egy órán át állni hagytuk. Az oldatot Sephadex G25 oszlopon kromatográfiás úton tisztítottuk, az oszlopot pedig 0,1 mólos nátrium-foszfát pufferrel (pH = 6,0) egyenlítettük ki. így a Fab’ fragmentum oldatát kaptuk, amely az N,N -etilén-bisz(jód-acetamid) maradékát is tartalmazta. A kapott oldathoz a 2. (b) példa szerint előállított A fragmentumot adtuk úgy, hogy az N.N-eth lén-bisz(jód-acetamid) maradékot tartalmazó Fab fragmentum és az A fragmentum aránya 1:2 legyen. Ezután a 3. példában leírt módon jártunk el, és így olyan protein hibridet állíotttunk elő, amelyben a Fab’ fragmentumot és az A fragmentumot az N,N - -eti!én-bisz(jód-acetamid) tárhálósító reagens segítségével a megfelelő kénatomokon keresztül kapcsoltuk össze. Ez a protein hibrid csaknem ugyanolyan kiváló citotoxicitást mutatott az L-1210-el szemben, mint az 1. példa szerint előállított hibrid. 7. példa A 6. példa szerinti eljárással tumorellenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab fragmentumot és az A fragmentumot a 6.,példában használt Nhl -etilén-bisz(jód-acetamid) térhálósító reagens helyett N,N -hexametilén-bisz(jód-acetamid) térhálósító szer segítségével kapcsoltuk össze egymással, a megfelelő kénatomokon keresztül. 8. példa A 6. példa szerinti eljárással tumorellenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab’ fragmentumot és az A fragmentumot a 6. példában használt N,N -etilén-bisz(jód-acetamid) térhálósító reagens helyett N,N’-undexametilén-bisz(jód-acetamid) térhálósító szer segítségével kapcsoltuk össze egymással, a megfelelő kénatomokon keresztül. 9. példa A 6. példa szerinti eljárással tumorellenes protein hibridet állítottunk elő, amelyben a Fab’ fragmentumod és az A fragmentumot a 6. példában használt N,N -etilén-bisz(jód-acetamid) tárhálósító reagens helyett bisz(N-maleinimid-metil)-éter térhálósító szerrel kapcsoltuk össze egymással, a megfelelő kénatomo-184.736 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
