184714. lajstromszámú szabadalom • Eljárás liposzóma-szuszpenziók tisztítására
1 2 A találmány tárgya eljárás tisztított liposzómák előállítására. Részletesebben a találmány liposzóma-szuszpenziók előállítására, tisztítására és a liposzómák stabilizálására vonatkozik. A liposzómák gyógyászati készítmények, melyekben a gyógyszer vagy diszpergált formában van jelen, vagy pedig vizes koncentrikus rétegekből álló testecskékben, melyek a lipid rétegekhez (hidrofób jellegűek) tapadnak, az inhomogén rendszerben — melyet általában liposzóma-szuszpenziónak neveznek — a gyógyszer jelen lehet akár a vizes rétegben, akár a lipid rétegben (belül vagy kívül), valamint bármilyen más módon. Általában, de nem kizárólagosan, a hidrofób réteg foszfolipidekből (ilyen például a lecitin és a sfingomielin), szteroidokból (pl. koleszterin), többé-kevésbé ionos felületaktív anyagokból (pl. dicetil-foszfát, sztearil-amin és foszfatidsav) és/vagy más hidrofób tulajdonságú anyagból áll, A liposzómák átmérője általában 15 nm és 5 mikrométer között változik. Az előállítási eljárás két fő lépésből áll, melyeket általában ismert módon hajtunk végre. Az első lépés a liposzómák előállítása, a második azok megtisztítása a szabad gyógyszertől. 1) A liposzómák előállítása: a lipid- vagy a lipofil komponenseket megfelelő oldószerben feloldjuk, majd - általában vákuumban — szárazra pároljuk. A gyógyszert tartalmazó vizes fázist beleöntjük a maradékot vékony réteg formájában tartalmazó lombikba, és a keveréket mechanikusan vagy ultrahanggal rázzuk egy ideig, ami 10 sec és néhány óra között változhat. Az így kapott inhomogén fázist — a liposzóma-szuszpenziót — meg kell tisztítani a szabad gyógyszertől. 2) A liposzómák elkülönítése a szabad gyógyszertől Ismert eljárás szerint a liposzóma szuszpenziók tisztítását oszlopkromatográfiás módszerrel, ultracentrifugálással, dialízissel, gélszűréssel végzik. Ezek az eljárások több hátránnyal rendelkeznek. Az oszlopkromatografálásnál kizárólag molekulaszűrő típusú gyantákat alkalmaznak a szabad gyógyszer megkötésére (pl. Sepharose®2B, 4B vagy 6B típusok), és a módszer hátránya, hogy az elérhető maximális liposzóma-koncentráció 0,3 mg/ml. Az ultracentrifugálásos tisztítási eljárás során (pl. Roseman, M. et. al., Biochem. B.A., 406, 347, /1975/, Kinsky, S.C., B.B. A., 265, 1, /1975J) a 150.000 g-vel végzett ultracentrifugálás igen sűrű üledéket eredményez, amelynek ismételt szuszpendálása nehézséget jelenthet, továbbá unilamellás SUV liposzómák jelenléte esetén a módszer nem alkalmazható, azok igen kis mérete miatt. A dialízissel történő tisztítás (pl. Kinsky, S.C. előzőén hivatkozott cikke, Raugham, A.D., et. al., J. MOI. Biol., 13, 238 /1965/) hátránya időigényessége (24— -28 óra), valamint a nem kvantitatív visszanyerés. Ez utóbbi hátrányai rendelkezik az esetleges membránill. gél-gyógyszer kölcsönhatás következtében az ultraszűrés és a gélszűrés is (Kinsky, S.C. előzőben hivatkozott cikke, Juliano, R. L. és Stäup. D., Biochem. Biophys. Res. Comm., 63, 651 /1975/, Gregoriadis, G. és Neerunjun, D.E., Eur. J. Biochem. 47,179/1974/). Liposzóma szuszpenziók, mint gyógyszerkészítmények tisztítására ioncserélő gyantákat eddig még nem alkalmaztak. A 4.145.304. számú amerikai szabadalmi leírásban közölt eljárás antibiotikumok és mérgező anyagok eltávolítására vonatkozik biológiai folyadékokból, a 3.784.584. számú amerikai szabadalmi leírás eljárást ismertet mérgek és/vagy gyógyszerek eltávolítására vérből nem ionos gyantákkal, a 3.398.092. számú amerikai szabadalmi leírás pedig funkciós csoporttal rendelkező különböző gyanták alkalmazását ismerteti, kizárólag víztisztítási célra. Elsőként ismertük fel, hogy az ioncserélő típusú gyanták inhomogén rendszerek, így liposzóma szuszpenziók tisztítására is alkalmazhatók, és ez az eljárás a hagyományos eljárásokhoz viszonyítva számos előnnyel rendelkezik. Jelen találmány tárgya új eljárás liposzóma-szuszpenziók előállítására a kapott inhomobén rendszer tisztítására önmagában ismert, a hatóanyag megkötésére alkalmas szilárd vagy folyékony polimerekkel, melyek általában szintetikus vagy természetes eredetű, funkciós csoportokkal rendelkező és ioncserélőként alkalmazható anyagok, műit például äz ioncserélő gyantaként, divinií-benzoí, akril- és metakrilsav. A felsorolt gyantákból egyet vagy többet, pontosan kimért mennyiségben közvetlenül abba az edénybe adagolunk, amely a tisztítandó liposzóma-szuszpenziót tartalmazza, majd az edényt 10-60 percig rázzuk. Szűrés után — melyet zsugorított üvegszűrővel végzünk, amely képes felfogni az ioncserélő gyantát, amelyen a szabad gyógyszer abszorbeálódott - tiszta és liofiljzálható liposzóma-z szuszpenziót kapunk. A liposzóma-szuszpenziók ioncserélő gyantával történő tisztítása azzal a nagy előnnyel rendelkezik, hogy általa igen tömény liposzóma-szuszpenziókat (egészen 5 mg/ml doxorubicín-hidroklorid töménységig) kapunk, melyeket molekuláris szűrőoszlopon történő kromatográfiás eljárással nem tudunk elérni (maximum 0,3 mg/ml). A kapott liposzóma-szuszpenziók igen stabilak, és ellentétben az ultracentrifugálással nyert anyaggal, ülepedésre nem hajlamosak. Ezeken túlmenően a találmány szerinti eljárás előnye még, hogy egyszerű eszközökkel, speciális berendezések nélkül (például kromatografáló oszlop, ultracentrifuga stb.) rövid idő alatt (max. 60 perc), gazdaságosan kivitelezhető, így iparilag előnyösen alkalmazható. Ugyanezt az eredményt érjük el, ha ioncserélő gyanta helyett olyan polimereket és kopolimereket alkalmazunk, amelyek nem rendelkeznek specifikus kémiai funkciós csoportokkal, és melyek általában, de nem kizárólagosan, a Van der Walls’ erők révén reagálnak, és melyek általában abszorbens gyantákként ismeretesek. A liposzóma vázat alkotó hidrofób anyagok és a többé-kevésbé hidrofil tulajdonságú gyógyszerek közti polaritásbeli különbség miatt ezeket a gyantákat felhasználhatjuk a Uposzóma-szuszpenziók tisztítására. A liposzóma-szu$zpenzió végső kémiai stabilizálását liofilizálással érjük el. A példákban alkalmazott gyógyszerek kémiai megnevezése a következő: Doxorubicin: (88-cisz)-10-/(3-amino-2,3,6-tridezoxi-a-L-lixo-hexopiranozil)-oxi/-7,8,9,10-tetrahidro-6, 8,11 -trihidroxi-8-(hidroxi-acetil> I -metoxi-5,12-naftacén-dion. 184.714 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 2
