184256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellenes hatású antibiotikum komplexek előállítására
1 184 256 2 a dózisokat meghatároztuk a legkisebb hatásos dózist (MED), mely a kezelt állatoknál 1,25-ször hosszabb túlélési időt jelentett â kontroll csoporthoz viszonyítva. Ezt az aktivitási szintet tekintik a lényeges rákellenes hatás mértékének. A‘6. táblázatban látható eredmények a számított aktivitási arányokkal azt mutatják, hogy a BBM-928 A lényegesen aktívabb, mint a mitomicin C, a tumor-törzstől és a kezelési programtól függően 10-300-szor. a BBM-928 A, B, C és D, valamint a mitomicin C intraperitoneális LD50 értékeit Van der Werden módszerével határoztuk meg [Arch. Expt. Path. Pharmak., 195, 389 (1940)], és szintén láthatók a 6. táblázatban. 6. táblázat A BBM-928 A, B, C és D, valamint a mitomicin-C rákellenes hatása és toxicitása Kezelésa Minimális hatásos dózis (MED, mg/kg/nap) LD50 P388 L1210 B16 LL S180 (mgjkgínap) BBM-928 A 0,003 0,1 0,003 0,03 0,003 0,13 BBM-928-B 0,1-— — 0,18 BBM-928 C~ —— 0,81 BBM-928 D 0,003-_ — 0,083 Mitomicin-C Kezelésb 0,1 3 1 0,3 0,3 9,3 BBM-928 A 0,001 0,003 0,003 0,003 0,0001 0,013 Mitomicin-C 0,1 Aktivitási arány (BBM-0,3 0,3 0,3 928 A|Mitomicin-C) 0,3 1,4 Kezelés3 30 ~ 300 10 100 Kezeiésb 100 100 100 100 100 a: egyszeri kezelés az 1. napon b: napi kezelés az 1-9. napokon. A találmány szerinti eljárást a továbbiakban példákkal szemléltetjük. 1. példa A G455—101 jelű Aktinomyces faj egyik törzsének jól kinőtt ferde tenyészetével 2% oldható keményítőt, 1% glükózt, 0,5% Pharmamédiát, 0,5% élesztőkivonatot, 0,5% A típusú NZ-amint és 0,1% kalcium-karbonátot (pH = 7,2 sterilezés előtt) tartalmazó vegetatív táptalajt oltunk. A szaporító tenyészetet 72 óráig 32 °C-on inkubáljuk rotációs rázógépen (250 min-1 ), és a kinőtt tenyészetből 5 millilitert 100 milliliter 2% oldható keményítőt, 1% Pharmamédiát, 0,003% hét molekula kristályvizet tartalmazó cink-szulfátot és 0,4% kalcium-karbonátot tartalmazó fermentációs táptalajba oltunk (500 milliliteres Erlenmeyer lombikban). A BBM-928 komplex legnagyobb koncentrációját körülbelül 5 napos rázott lombikban való tenyésztés után éri el. A szaporító tenyészetet 4 napig rázatjuk Erlenmeyer lombikokban, 100 liter csíráztató táptalajba oltjuk, összetétele 2% zabliszt (Quaker Products, Ausztrália), 0,5% glükóz, 0,2% száraz élesztő, 0,0008% négy kristályvizet tartalmazó mangán(II)-klorid, 0,0007% hét kristályvizet tartalmazó réz(Il)-szulfát, 0,0002% hét kristályvizet tartalmazó cink-szulfát és 0,0001% hét kristályvizet tartalmazó vas(II)-szulfát, majd 200 literes szaporító fermentorban 200 min'1 fordulatszámmal kevertetjük 30 °C-on 54 órán át. A szaporító táptalaj 15 liter térfogatú részét 170 liter 2% oldható keményítőt, 1,0% Pharmamédiát, 0,0003% hét kritályvizet tartalmazó cinkszulfátot és 0,4% kalcium-karbonátot tartalmazó fermentációs táptalajba oltjuk, 400 literes fermentorban, 30 °C- on 150 liter/perc levegőztetési sebességgel és 200 min-1 fordulatszámmal kevertetve növekedés közben. A táptalaj pH-ja a fermentáció előrehaladtával fokozatosan növekszik, és 100-200 óra után eléri a 8,4—8,5 értéket, mikor is az antibiotikum-termelés a 30 pg/ml csúcsértéket éri el. 2. példa Az 1. példában leírt (170 liter, pH = 8,5) tenyészlevet szűrési segédanyaggal leszűrjük. Az antibiotikum-aktivitást mind a szűrletben, mind a szűrési maradékban megtaláljuk. A micélium-pogácsát kétszer extraháljuk az aceton-metanol oldószerkeverékkel (1:1, 2 X 30 liter). Az extraktumokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk, hogy n-butanollal extrahálható vizes sűrítményt kapjunk. A tápoldat szűrletét kétszer extraháljuk n-butanollal (2 X 40 liter). Az egyesített n-butanol extraktumok csökkentett nyomáson való bepárlásával és a maradék fagyasztva szárításával 21,4 g nyers szilárd anyagot kapunk. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatok szerint ez az anyag összetett, három fő komponenst, A-t, B-t és C-t és három mellékkomponenst, D-t, E-t és F-et tartalmaz, Rf-értéküket az alábbi, 7. táblázatban közöljük. 7. táblázat A BBM-928 komponensek szilikagélen végzett vékonyréteg-kro matográfiája Rfértékek' N-118 rendszer** N» 103 rendszer*** BBM-928 A 0,71 0,48 BBM-928 B 0,53 0,26 BBM-928 C a 27 0,07 BBM-928 D 0,73 0,53 BBM-928 E 0,56 0,34 BBM-928 F 0,39 0,17 ‘Detektálás UV scannerrel (Shimadzu CS-910) 345 nm-nél. **n-Butanol-metanol-víz 6327:10 arányú elegye. * * * Xilol-metil-etil-keton-metanol 5:5:1 arányú elegye. 3. példa A 2. példában kapott nyers komplexet preparatív ellenáramú megoszlási berendezésben (Mitamura, 100 ml/cső) széntetraklorid-kloroform-metanol-víz oldószer eleggyel tisztítjuk. Az 50. lépés után az 5-20. csövek tartalmát egyesítjük, bepárolva 4,4 g halványsárga port kapunk, mely az A, B, D, E és F komponenseket tartalmazza. Ezt a keveréket kis mennyiségű kloroformban oldjuk, és etilacetáttal előkezelt, 500 ml térfogatú C—200 szilikagél oszlopra töltjük. Az oszlopot növekvő mennyiségű (2-5 tf.%) metanolt tartalmazó etil-acetáttal eluáljuk, és a frakciókat 345 nm-en optikai sűrűségük alapján ellenőrizzük. A D mellék-komponens eluálódik először etil acetáttal, majd az A komponens. Az E, B és F eluálódnak ezután ebben a sorrendben a 3% metanol koncentrációnál. Mindegyik, a megfelelő komponenst tartalmazó frakciót csökkentett nyomáson bepároljuk, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
