184125. lajstromszámú szabadalom • Új genetikai eljárás antibiotikumot termelő micromonospóra törzsek előállítására
9 10 1 % glükóz 0,4 % pepton 0,4 % élerztőkivonat 0,3 % glicin 0,2 % kál um-dihidrogén-foszfát 0,4 % dik álium-hidrogén-foszfát 0,05 % ma gnézium-szulfát-víz (1/7) 2 ml/1 nyomelem oldat desztillált vízben oldva. A tenyészetet sikrázógépen (320 min'1) 42-44 órán át 37 C°-on inkubáijuk. Ezután mindkét tenyészetét sterilen le centrifugáljuk (6000 min'1,0 C°), és az üledéket 20 ml P táptalajban szuzsper dáljuk, melynek összetétele 0,2 M szacharóz 0,025 8/1 kálium-szulfát 0,025 M TRIS-HC1 puffer pH 7,2 50 mM 1 áIium(JI)klorid 50 mM nagnézium(II)-klorid 0,8 mM ' .álium-dihidrogén-fos :fát 2 ml/1 nyomelem oldat desztillált vízben. Az így kapott sziszpenziókat steriler lecentrifugáljuk (6000 min'1,0 C°), majd újra szuszpt ndáljuk 2 ml P2 táptalajban. A két szuszpenzió 1-1 ml éhez 1-1 ml 10 mg/ml koncentrációjú steril lizozim-olcatot adunk (a lizozim végkono ntrációja 5 mg/ml/. P lizozimet [Calbiochem (San Diego California) 17 ('00 E/mg] is P2 táptalajban old uk. A lízozimes tényé: zeteket 25 ml-es Erlenmeyer-lor bikban 37 C0-0!1 lassa a (30 min'1 ) rázatjuk. A tenyészetek mikroszkópos megfigyelés alapján 30-45 perc múlva kvantitative proto plaszttá alakulnak. Az így kapót protoplaszt szuszpenziókat sterilen lecentrifugáljuk (6000 min"1). A sztrr ptomicin-érzékeny mutáns protoy lasztját kétszer mossi k, azaz 10 ml R2 tápfolyadékbau felszuszpem áljuk, é: centrifugálás után ezt még egyszer megismételj! k. R2 Összetétele: 0,35 M szacharóz 0,25 8/' kálium-szulfát 1 % glükóz 0,3 °Á prolin 0,01 °Á kazein-hid’ olizáturn 50 mM kálcium(lI.'-kIorid 50 irM magnéziun (Il)-klorid 0,2 r iM kálium-dib drogén-foszfát 2 i-ü/1 nyomelem oldat desztillált ví; ben oldva. « A sztrept.mücin reziszters mutánst is kétszer mossuk P táptalajj á, majd 55 Ç -ra előmelegített 25 ml-es lombikban 1 ;vő 10 ml TRh táptalajra öntjük, melynek összetétele 1,2 :7o TRIS 0,035 % kálium-kit rid 0,1 % ammónium-klorid 0,03 % magnézíum(II)-klorid-víz (1/6) 0,0058 %' nátrium-klorid 0,03 % nátrium-szulfát-víz (1/10) 0,5 Pél ml vas(Il)-klorid 0,35 M szacharóz desztillált vízben oldva. A táptalaj pH-ját 7,5-re állítjuk. A lombikot rázás nélkül inkubáijuk 55 C°-on 3 óráig, majd óvatos rázogatással a protoplasztokat felszuszpendáljuk. A sztreptomicin érzékeny, hővel nem kezelt protoplaszt-szuszpenziót és a sztreptomicin rezisztens, hővel inaktivált protoplaszt-szuszpenziót 1:1 arányban összekeverjük, majd a kapott szuszpenzió 0,1 ml-ét 0,9 ml 50 %-os vizes polietiléngl kol oldattal (Ms 6000) 10 percig állni hagyjuk. A fúzionáltatott protoplasztokat tartalmazó szuszpenzió 0,05 ml-ét 3 ml 0,4 % agart tartalmazó R2 táptalajba csöppentjük. A kapott elegyet 2,2 % agart tartalmazó szilárt R2 táptalajra rétegezzük, majd 37 C°-on inkubáijuk. A 8. napin 3 ml 1000/jg/ml sztreptomicin-koncentrációjú, 0,5 °/l agart tartalmazó TRIS táptalajjal rétegezzük le a lemezeket. A 20. nap után megjelenő telepek protoplaszt-fűzió és ezt követő rekombináció eredrm nyeképpen nőttek ki. .?. példa A gentamicin-tern elő Micromonospora purpurea var. nigrescens törzs alábbi szülőpárjának 1. növekedéshez 1 azaminosavat igénylő 2. növekedéshez k azaminosavat nem igénylő protoplasztfúziójáho; a 2. példában leírt körülményeket alkalmazzuk. A kaza ninosavat nem igény. 3 mutánst a 2. példában a szterpiomicin-rezisztens mutánsra leírt módon hővel inaktív;Íjuk. A prototróf szülőből készült, hővel inaktivált protoplaszt szuszpenziót és a kazaminosav igényes szülőből készült, hővel nem inaktívált protoplaszt szuszpenziót a 2. példa szerint fuzionáltatjuk. A kapott elegyet 2,2 % agart tartalmazó, kazaminosav nélküli szilárd R2 táptalajra rétegezzük és 37 C°-on inkubáljuk. A 20-30 nap után megjelenő telepek protoplaszt-fúzió és ezt követő rekombináció eredményeképpen nőttek ki. 4. példa A fajok közötti fúíió igazolásához az alá. bi két szüb .párt alkalmaztuk: 1. Micromonospora purpurea var. nigrescer.; 100/Jg/rnl sztreptomicinre rezisztens 2. Micromonospora myoensis 0,5/ig/ml sztrepU micinre rezisztens A Micromonospora purpurea var. nigrescen törzsből i 2. példa szerint készítünk hővel inaktivált piotoplaszt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 <5
