184125. lajstromszámú szabadalom • Új genetikai eljárás antibiotikumot termelő micromonospóra törzsek előállítására
7 8 100 ml steril táptalajba, melynek összetétele 0,1 % kálium-nitrát 0,05 % dikálium-hidrogén-foszfát 0,05 % magnézium-szulfát-víz (1/7) 0,05 % nátrium-klorid 1 % glükóz 0,1 % élesztökivonat 0,3 % kazaminosav 0,2 % glicin desztillált vízben. Átoltás után a tenyészetet ezen a táptalajon 48 órán át rázógépen inkubáljuk 37 C°-on. Az inokulumtáptalajba oltott Cas+Rif^ törzs tenyészetét 65 órán át 37 C°-on rázógépen inkubáljuk, majd sterilen átoltjuk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő' 100 ml steril táptalajba, melynek összetétele 0,1 % kálium-nitrát 0,05 % dikálium-hidrogén-foszfát 0,05 % magnézium-szulfát-víz (1/7) 0,05 % nátrium-klorid 1 % glükóz 0,1 % élesztőkivonat 0,5 % glicin desztillált vízben oldva. Átoltás után a tenyészetet ezen a táptalajon 23 órán át rázógépen inkubáljuk 37 C°-on. Ezután mindkét mutáns tenyészetét lecentrifugáljuk (6000 min"1), és az üledéket szuszpendáljuk 20 ml Pt táptalajban, melynek összetétele 0,2 M szacharóz 0,25 g g/lg kálium(I)-szulfát 0,025 M TR1S-HC1 puffer pH 7,2 (TRIS = trisz/hidroxi-metil)-aminome tán 50 mM magnézium(II)-klorid 10 mM kalcium(H)-klorid 0,8 mM dikálium-hidrogén-foszfát 2 ml/1 nyomelem oldat desztillált vízben oldva. A nyomelem oldat összetétele 40 mg/i cínk(II)-klorid 200 mg/1 vas(III)-klorid-víz (1/6) 10 mg/1 réz(II)-klorid-\íz (1/2) 10 mg/1 mangán(II)-klorid-víz (1/4) 10 mg/1 dinátrium-tetraborát-víz (1/10) 10 mg/1 ammónium-molibdát(VI)-víz (1/4) Az így kapott szuszpenziókat sterilen lecentrifugáljuk (6000 min"1), és újra szuszpendáljuk 2 ml Pj táptalajban. A két szuszpenzió 1 — 1 ml-éhez sterilen 1 — 1 ml 20 mg/ml koncentrációjú steril lizozim-oldatot adunk (a lizozim végkoncentrációja 10 mg/ml/. A lizozimot [Calbiochem (San Diego California) 17 000 E/mg] P, táptalajban oldjuk. A lizozimes tenyészeteket 25 ml-es Erlenmeyer-lombikban 37 C°-on lassan rázatjuk. A tenyészetek mikroszkópos megfigyelés alapján 30-60 perc múlva kvantitatíve protoplaszttá alakulnak. A kapott protoplaszt-szuszpenziókat sterilen centrifugáljuk, majd újra szuszpendáljuk 2 ml P táptalajba, és ezt a műveletet még egyszer megismételjük. A protoplaszt-fúzió végrehajtásához a két különböző mutáns protoplaszt-szuszpenziót 1:1 arányban összekeverjük, majd a szuszpenzió 0,1 ml-ét 0,9 ml 15 % dimetilszulfoxidot tartalmazó 50 %-os vizes polietilénglikollal (Ms 6000) 30 percig állni hagyjuk. A polietilénglikollal kezelt szuszpenzió 0,05 ml-ét 0,5 % agart tartalmazó lágy táptalajba csöppentjük. A kapott elegyet 2,2 % agart tartalmazó szilárd R( táptalajra rétegezzük. Az R( táptalaj összetétele 0,2 M szacharóz 0,25 g/1 kálium(I)-szulfát 1 % glükóz 0,3 % prolin 0,01 % kazaminosav 2 ml/1 nyomelem oldat 0,025 M TRIS-HC1 puffer pH 7,5 50 mM magnézium(Il)-klorid 10 mM kálcium(ll)-klorid 0,2 mM kálium-dihidrogén-foszfát 0,1 % élesztőkivonat desztillált vízben. 20 nap után a 32 C°-on kinőtt telepeket fiziológiás konyhasóoldattal lemossuk, és az alábbi összetételű táptalajra szélesztjük: 0,1 % kálium-nitrát 0,05 % dikálium-hidrogén-foszfát 0,05 % magnézium-szulfát-víz (1/7) 0,05 % nátrium-klorid 0,001 % vas-szulfát-víz (1/7) 2 % vízoldható keményítő 0,001 % rifampicin 1,5 % agar desztillált vízben oldva. 4—6 napos inkubáció után az ezen a táptalajon kinőtt telepek a szülőkhöz képest megváltozott genetikai állománnyal rendelkeznek. 2. példa A gentamicint termelő Micromonospora purpurea var. nigrescens (MNG 00122) törzs két alábbi mutánsának 1. sztreptomicin rezisztens Sm^ 2. sztreptomicin érzékeny Sm^ mélyhűtve tárolt vegetatív micéliumával steril körülmények között beoltunk 500 ml-es Erlenmeyer-loinbikban levő 100 ml steril táptalajt, melynek összetétele 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
