183978. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növények szaporítóanyagának előállítására szövettenyészetben
1 183 978 2 lettségű rügyet, oldalhajtást visel. Ezt a részt újabb dugványok nyerése céljából steril körülmények között feldaraboljuk. A dugványokat a már leírt módon újból hormonmentes szilárd táptalajba ültetjük, elárasztjuk folyékony tápoldattal, és az eljárást a kívánt csúcshajtásszám eléréséig megismételjük. Feltehetően azért, mert a szárazföldi növények asszimilációjának és lélegzésének a körülményei a folyadék alatt megváltoznak (fényelnyelődés, a gázok vízben oldott állapotban vannak jelen stb.), előnyösnek bizonyult, ha a szubmerz tenyészetet a szokásosnál hosszabb ideig világítjuk meg, vagy megszakítás nélküli világítást alkalmazunk. A találmányt az alábbi példákkal szemléltetjük anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk. 1. példa Amsonia tabernaemontana szubmerz szaporítása növekedésszabályozó anyag jelenlétében A Gyógynövény Kutató Intézet Amsonia tabemaemontana gyűjteményében levő 10-15 éves, hatóanyagtartalom szempontjából megvizsgált növények közül kiválasztottunk egy 12,26 % taberszonin tartalmú növényt és arról áprilisban körülbelül 20 leveles, 25-30 cm hosszú hajtásokat vágtunk le. A hajtásokat — a könynyebb kezelhetőség érdekében — rövidebb, körülbelül 10 cm-es darabokra vágtuk és egy óra hosszat folyó csapvízben mostuk. Ezután a leveleket körülbelül 1/4-nyire visszavágtuk, és az ilyen hajtásdarabokat 3 %-os Na-hipoklorit-oldatban (1:10 arányban hígított háztartási Hypo) 15 percig, állandó rázogatás közben fertőtlenítettük. A fertőtlenítő folyadékból az anyagok autoklávozással sterilizált desztillált vízbe helyeztük és ott — ugyancsak rázogatva — 10 percig tartottuk. Az utóbbi kezelést és a további műveleteket steril gyógyszertári oltószekrényben. aszeptikus körülmények között végeztük. A steril vízből kivett hajtásokat hővel sterilizált Petri csészében szikével 2-3 leveles darabokra vágtuk fel úgy, hogy az alsó levél alatt körülbelül 1 cm hajtásrész maradjon. Az így készített dugványokat 200 ml-es üveglombikokba ültettük. Az üveglombíkok 100-100 ml módosított Murashige— Skoog féle táptalajt tartalmaztak, amelynek összetétele az alábbi: NH^NOa 1650 mg/liter kno3 1900 mg/liter CaCl2-2H20 440 mg/liter MgS04-7H20 370 mg/liter kh2po4 170 mg/liter Na2EDTA 37,2 mg/liter FeS04-7EI20 27,8 mg/liter H3BO3 6,2 mg/liter MnS04-7H20 22,3 mg/liter ZnS04 *7H20 8,6 mg/liter KI 0,83 mg/liter Na2Mo04-2H,0 0,25 mg/liter CuS04*5H20 0,025 mg/liter CoC12 • 6H2 O 0,025 mg/liter Szaharóz 30 000 mg/liter Agar-agar 10 000 mg/liter Nikotinsav 0,5 mg/liter Piridoxin*HCl 0,5 mg/liter Tiamin*HCl 0,1 mg/liter Murashige, T., Skoog, F.: A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum 15, 473—497. (1962). Ültetéskor arra ügyeltünk, hogy a dugványok az alsó levélig a táptalajba merüljenek. A dugványokat 20-25 °C hőmérsékleten, 10 000 lux erősségű mesterséges megvilágítás és sötét periódus 16fl/8*1 váltakozásával neveltük. A dugványokon egy hét után a levélhónaljban rügyek jelenték meg, amelyek további 2 hét után 10-12 leveles fejlettségű (körülbelül 5-7 cm hosszú) hajtások lettek. Ezeket a steril oldalhajtásokat a dugványról leválasztottuk és 2—4 leveles darabokra vágtuk. Az így készített dugványokat a fent megadott összetételű táptalajba dugványoztuk úgy, hogy a dugványok elég mélyen (legalább 1 cin) a táptalajba hatoljanak. (Ehhez a dugványokat úgy vágíuk, hogy a hajtásdarabok alsó levele alatt ilyen hoszszúrágú szárrész legyen). Ezután a fenti összetételű, agar-agart nem tartalmazó, 1 Mg/1 6-benzi!-amino-purinnal kiegészített folyékony táptalaj 50—50 ml-jét öntöttük mindegyik 200 ml-es üveglombikba, a dugványokra. A dugványokat ezt követően 8000 lux erősségű állandó mesterséges megvilágítással, 20—25 °C-on tartottuk. A dugványok valamennyi levélhónaljából rügyek hajtottak ki, amelyek 3—4 hét után 5—10 cm hosszúságot is elérték és fő jellemzőjük az volt, hogy az újonnan keletkezett hajtások levélhónaljából is rügyek, hajtások fejlődtek. A legerősebb hajtások ki is nőttek a folyékony táptalajból, és ennek következtében a hajtás levegőn levő részén már nem, vagy csak kevéssé jelentek meg az oldalrügyek a levélhónaljakban. Ekkor a hajtástenyészeteket feldaraboltuk úgy, hogy az 5-7 leveles hajtáscsúcsokat levágtuk, az alap és középrészt pedig 5-10 rügyet vagy 2-4 levelet viselő darabokra vágtuk. A hajtáscsúcsokat a fent megadott összetételű szilárd táptalajba dugvár.yoztuk, ahol 2 hét alatt erős gyökérzetet fejlesztettek, és földbe ültethetők lettek. Az alap- és a középrészből készített dugványokat ugyancsak a megadott összetételű szilárd táptalajba ültettük, majd az elültetett dugványokra - a fentieknek megfelelően - 1 mg/l 6-benzii-amíno-purínt tartalmazó folyékony tápoldatot öntöttünk, és a tenyészeteket 20-25 °C-on 8000 lux erősségű állandó mesterséges megvilágítással tenyésztettük 2-4 hétig. Ez alatt az idő alatt a már meglevő kis hajtások, kihajtott rügyek tovább növekedtek, és mind a régi, mind az új hajtásokon újabbak jelentek meg. A hajtástenyészet csúcshajtásaiból megfelelő fejlettségi állapotban való feldarabolás után ismét gyökeres növények voltak nevelhetők, míg az alap- és a középrészekből az elágaztatás ismétlése révén újból tömeges rügy- és hajtásanyag nyerhető. Az eljárás rendszeres megismétlésével egy hajtásból kiindulva egy év alatt több millió gyökeres növény állítható elő. 2. példa A tárkony (Artemisia dracuncùlus) szubmerz szaporítása ncvekedésszabályozó nélkül A tárkony (Artemisia dracunculus) Zöld zamat fajta szabadföldi növényeiből júniusban körülbelül 10 cm hosszú hajtásokat vágtunk le. A hajtásokat 2 óra hosszat mostuk folyó csapvízben, majd 3 %-os Na-hipoklorit 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
