183945. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozin Ó1 szekvencia fragmenseinek előállítására
1 2 183 945 Találmányunk új timozin a, szekvencia fragmenseinek előállítására vonatkozik. A timozin a, 28 aminosav-maradékból álló, hőstabil, nagymértékben savas polipeptid, amely a (VI) képletnek felel meg. Ezt az erős immunfokozó hatással rendelkező pepiidet Goldstein és munkatársai ioncserés kromatográfiával és gélszűréssel különítették el timozin-frakció 5-ből [proc. Natl. Acad. Sei. USA.] Azt találtuk, hogy a timozin szekvencia fragmenseit képező bizonyos peptidek a T-sejtek szabályozása, differenciálása és funkciója terén hatást fejtenek ki. Ezek a peptidek a (ül), (TV) és (V) képletnek felelnek meg. Találmányunk tárgya eljárás timozin (I) általános képlett! timozin ai szekvencia fragmenseinek (mely képletben R1 jelentése hidrogénatom, H-Glu-Lys-Lys- vagy H-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys) előállítására oly módon, hogy valamely (II) általános képlett! védett pepiidből (mely képletben R2 jelentése Boc. Boc-glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys-(Z)- vagy Boc-Asp(OBzI)-Leu-Lys(Z)-GIu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-; Boc jelentése tercier butoxikarbonilcsoport; Bzl jelentése benzilcsoport és Z jelentése benziloxikarbonilcsoport) a védőcsoportokat lehasítjuk. A (II) általános képlett! védett peptidekben levő védőcsoportok eltávolítását önmagukban ismert módszerekkel végezhetjük el. A védőcsoportokat pl. valamely vízmentes savval (mint pl. hidrogén-fluoriddal) előnyösen anizol jelenlétében történő kezeléssel hajthatjuk végre. Az (I) általános képlett! peptidek kémiai szintézisénél az alábbi stratégiát alkalmazzuk: Először H-Glu(OBzl)-OH-t Boc-Ala-OSu-val kapcsolunk,majd a kapott, Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH képleté védett dipeptid-fragmenst a DCC/HOSu módszer szerint [lásd Wünsch és Drees: Chem. Ber. 99, 110 (1966)] H-Asn-OBzl. HCl-al kondenzáljuk. Az aszparaginsavbenzilészter-hidrokloridot Boc-Asn-OBzI-bőI állítjuk elő; ezt az utóbbi vegyületet a kereskedelemben kapható Boc-Asn-OH céziumsója és benzilbromid kondenzációjával alakítjuk ki. A Boc védőcsoport lehasítása során a védett vegyületet vízmentes tetrahidrofuránban 30 percig 4 n sósavoldattal kezeljük. Ezután H-Glu(OBzl)-OH és Boc-Glu(OBzl)-OSu reakciójával Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)OH-t állítunk elő átlátszó, színtelen olaj formájában. A kapott vegyületet DCC/HOSu közvetítésével végrehajtott ffagmenskondenzációban H-Ala-Glu(OBzl)Asn-OBzl.HCl-al reagáltatjuk (az utóbbi reagenst Boc-Ala-Glu(OBzl)Asn-OBzl-ből állítjuk elő, tetrahidrofurános közegben 4 n sósavoldattal végzett kezeléssel). A kondenzáció során tiszta, kristályos anyagformájában jó hozammal kapjuk a Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl képleté védett pentapeptidet. A Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)Asn-OBzl képleté védett oktapeptid szintézise során először a reagensként felhasználandó, Boc-Glu (OBzl)-Val-Val-OH képleté védett tripeptidet állítjuk elő. A védett tripeptid előállításának első lépésében Boc-Val-OSU-t szabad valinnal reagáltatnunk, a kapott Boc-Val-Val-OH képleté termék védőcsoportját tetrahidrofurános közegben 4 n sósavoldattal lehasítjuk, majd a védőcsoportmentes terméket Boc-Glu(OBzl)-Osu-val reagáltatjuk. Ekkor a kívánt tripeptídhez jutunk, amelyet kristályos ciklihexilaminsója [Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH. CHA] formájában különítünk el. A ciklohexilaminsóból felszabadítjuk a savat, majd a szabad savat HOSu jelenlé-2 tében, DCC felhasználásával H-Glu(OBzI)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl.HCl-hoz kapcsoljuk. Ezt az utóbbi reagenst Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu (OBzl)-Asn-OBzl tetrahidrofurános közegben végzett só- 5 savas kezelésével alakítjuk ki. A kapcsolási reakcióban kialakult, Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl képleté védett oktapeptidet tisztítás után amorf, szilárd anyag formájában különítjük el. A védett oktapeptid védőcsoportjait hidrogenolízissel 10 és azt követő trifluorecetsavas kezeléssel ismert módon lehasítjuk, és a képződött Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn képleté szabad oktapeptidet ioncserés oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Vékony rétegkromatográfiás vizsgálat és papírelektroforézis szerint egységes terméket 15 kapunk. A következő műveletsorozatban a Boc-Glu(OBzl)-Lay(Z)-Lys(Z)-GIu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl képleté védett undekapeptidet alakítjuk ki. A szintézis első lépésében Boc- 20 -Lys(Z)Osu és H-Lys(Z)-OH reakciójával Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-t állítunk elő, majd ezt a dipeptidet tetrahidrofuránban 4 n sósavoldattal kezeljük. A képződött H-Lys(Z)-Lys(Z)-OH.HCl-t Boc-Glu(OBzl)-Osu-val reagáltatjuk, majd a kapott Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)- 25 -OH képleté tripeptidet Weygand és munkatársai módszerével [Z. Naturforsch. 21b, 426 (1966)] DCC/HOSu eleggyel aktiváljuk. A kialakult, Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu képleté aktív tripeptid-észtert magában a képződési reakcióelegyben H-Glu(OBzl)-Val-Val- 30 -Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-Obzl trifluoracetát-sójával reagáltatjuk (ezt a reagenst a megfelelő, védett oktapeptid és trifluorecetsav 30 perces reakciójával alakítjuk ki). A reakcióelegyhez kis mennyiségű bázist adunk. Termékként Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)- 35 -Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzI képleté védett undekapeptidet kapunk. A kapott védett undekapeptid védőcsoportjait vízmentes hidrogénfluoriddal végzett kezeléssel hasíthatjuk le. A képződött, Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala- 40 -Glu-Asn képleté szabad undekapeptid ioncserés oszlopkromatográfiás tisztítás után papír-elektroforézis szerint egységes termék. A védett tetradekapeptidet a fentihez hasonló módszerrel alakítjuk ki. Boc-Leu-Osu és H-Lys(Z)OH kapcsolá- 45 sával Boc-Leu-Lys(Z)-OH-t állítunk elő. A kapott vegyület N“-Boc-csoportját tetrahidrofurános közegben 4 n sósavoldattal végzett kezeléssel lehasítjuk, és az (így kapott vegyületet Boc-Asp(OBzl)-OSu-val reagáltatjuk. Tiszta, kristályos szilárd anyagként Boc-Asp(OBzl)-Leu- 50 -Lys(Z)-OH képleté védett tripeptidet kapunk. Ezt a vegyületet Bos-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OSu képleté aktív észterévé alakítjuk, majd az aktív észért H-GIu(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Asn-OBzl trifluoracetát-sójával (a megfelelő vé- 55 dett undekapeptid és trifluorecetsav reakciójával kapott termék) kondenzáljuk. A kívánt Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Alu-Glu(OBzl)-Asn-Obzl képleté védett tetradekapeptidet jó hozammal kapjuk. A termék 60 vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint homogén. Ha a kapott védett vegyületet vízmentes hidrogénfluoriddal kezeljük, majd a terméket ioncserés oszlopkromatográfiával tisztítjuk, a megfelelő, Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn képleté szabad 65 tetradekapeptidhez jutunk.
