183945. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozin Ó1 szekvencia fragmenseinek előállítására
1 2 183 945 A találmányunk szerinti eljárással előállítható (I) általános képletű okta- undeka- és tetradekapeptideket melegvérű állatoknak parenterális úton, éspedig intravénásán, szubkutáns módon vagy intramuszkulárisan adhatjuk be. Az (I) általános képletű vegyületek potens immunopotencírozó szerek hatóanyagaként alkalmazhatók és a napi hatóanyag-dózis általában kb. 1—100 mg/kg testsúly intravénás adagolás esetében. Az alkalmazott dózis természetesen az adott eset összes körülményeitől (a beteg állapotától, az eset súlyosságától és a kezelés időtartamától stb.) függ. Előnyösen alkalmazhatunk 1 mg liofilizált peptidet tartalmazó készítményeket, melyeket felhasználás előtt steril vízzel vagy nátrium-kloridoldattal hígítunk. A leírásban és az igénypontokban alkalmazott rövidítések jelentése a következő: Boc=terc. butoxikarbonilcsoport, Bzl=benzilcsoport, DCC=diciklohexilkarbodiimid, DMF=dimetil-formamid, THF=tetrahirofurán, HOSu=N-hidroxi-szukcinimid, Triton B=Trimetil-benzil-ammóniumhidroxid 40%-os metanolos oldata, NMM=N-metil-morfolina, CHA=ciklohexilamin, DCHA=diciklohexilamin, Z=Benziloxikarbonilcsoport, DMSO=dimetil-szulfoxid, TFA=trifluorecetsav, ET3N=trietilamin, HOBT=l-hidroxi-benzotriazol. Az (I) általános képletű okta-, undeka- és tetradekapeptidek találmányunk szerinti előállításának további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. A példákban a peptidek szintézisét bizonyos védőcsoportok kapcsán ismertetjük; a szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy a konkrétan megnevezett védőcsoportok helyett egyéb, azokkal egyenértékű védőcsoportok is felhasználhatók. 1. példa a) 11,0 g (47,5 mmól) Boc-Asn-OH 200 ml metanollal készített oldatához 20 ml vizet adunk. Az oldat pH-ját 20%-os vizes Cs2C03-oldattal 7,0-re állítjuk (ehhez körülbelül 55 ml oldatra van szükség). Az elegyet szárazra pároljuk és a maradékról 45 C-on 2x120 ml dimetilformamidot párolunk le. A kapott fehér, szilárd anyaghoz 8,9 g (52 mmól) benzilbromidot és 120 ml dimetilformamidot adunk, és az elegyet 6 órán át keverjük. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, és a maradékot nagymennyiségű vízzel kezeljük. A termék azonnal megszilárdul. A terméket leszűrjük, etilacetátban oldjuk, az oldatot vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, végül bepároljuk, és a kapott szilárd anyagot etilacetát és petroléter elegyéből kristályosítjuk. 13,8 g (90,3%) Boc-Asn-OBzl-t lápunk; op.: 120—122 C°; = - 17,29° (c=l, DMF). 13,7 g (42,4 mmól) Boc-Asn-OBzl-t 80 ml tetrahidrofuránban oldunk, és az oldathoz 500 ml 4 n tetrahidrofurános sósavoldatot adunk. Az elegyet 45 percig állni hagyjuk; ezalatt az elegyből a termék egy része kiválik. Az elegyhez 1000 ml étert adunk. Az éter hatására azonnal kivált fehér, szilárd anyagot leszűrjük, éterrel mossuk és vákuumban, szemcsés nátrium-hirdoxid fölött szárítjuk. 10,3 g (94%) HCl.H-Asn-Obzl-t kapunk; op.: 122— —126 C°,[a]^j = +6,82°. b) 7,0 g (29,5 mmól) H-Glu(OBzl)-OH-t dörzsmozsárban finomra aprítunk, majd az őrölt anyahoz 8,88 g (32,3 mmól) Boc-Ala-OSu-t, 250 ml dimetil-formamidot és 6 ml NMM-t adunk, és az elegyet 48 órán át keverjük. A reakcióelegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a reakció során az elegyhez további kis mennyiségű NMM-t is adunk. Az oldószert lepároljuk, és a maradékot 300 ml etilacetát és 500 ml víz és 2 ml 10%-os vizes 5 sósavoldat elegye között megoszlatjuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel háromszor mossuk, vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk, és szárazra pároljuk. A maradékot kevés éterben felvesszük, és az elegyhez nagy térfogatú petrolétert adunk. Fehér, amorf, vékonyréteg 10 kromatográfiásan egységes szilárd anyagot kapunk. Az így kapott 11,0 g (91,5%) Boc-Ala-Glu(OBzl)OH 84—88 C°-on olvad; [a] ^ = 8,08° (c=l, DMF). 10,4 g (25,4 mmól) Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH-t, 6,56 g 15 (24,5 mmól) HCl.H-Asn-OBzl-t és 5,9 g (50,8 mmól) HOSu-t 250 ml 0 C°-os dimetil-formamidban oldunk, és az oldathoz 5,7 g (27,6 mmól) DCC-t, majd közvetlenül ezután 3,5 ml Et3N-t adunk. Az elegyet 2 órán át 0 C-on, majd 40 óránát 25 C°-on keverjük; ezalatt az elegy eny- 20 hén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez időről-időre kis mennyiségű Et3N-t adunk. A képződött oldhatatlan melléktermékeket kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. Az olajos maradékot vizes kezeléssel megszilárdítjuk. A kapott nyersterméket kloroformban 25 felvesszük, a kloroformos oldatot vízzel háromszor mossuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, majd betöményítjük. A kivált kis mennyiségű szilárd anyagot (amely szennyezésként jelentős mennyiségű diciklohexilkarbamidot tartalmaz) kiszűrjük, és a szűrletet petrolé- 30 térrel kezeljük. Kristályos termék formájában 8,0 g (51,4%) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 102-105 C°, [a]-^- = 12,5° (c=l, DMF). c) 4,74 g (20 mmól) H-Glu(OBzl)-OH-t dörzsmozsár- 35 ban eldörzsölünk, majd dimetil-formamidos közegben, keverés közben 0,7 g (20 mmól) Boc-Glu(OBzl)-OSu-val és 3,6 ml NMM-el kezeljük. A képződött oldatot sziruppá bepároljuk, és a maradékot vízzel kezeljük. A kapott olajos csapadékot etilacetátban felvesszük, az oldatot 40 egymás után 5%-os vizes ecetsav-oldattal és vízzel háromszor mossuk, nátrium-szulfát fölött szárítjuk, majd szárazra pároljuk. A maradékként kapott 14,03 g átlátszó olajat petroléterrel fedjük, és a rendszert állni hagyjuk. Olajos termékként 10,2 g (90,0%) Boc-Glu(OBzl)- 45 -Glu(OBzl)-OH-t kapunk, amely vékonyrétegkromatog-25 ráfiás vizsgálat szerint egységes. [a]-g- = —7,59° (c=l, DMF). d) 28,2 g (46 mmól) Boc-Ala-Glu(OBzl)Asn-OBzl-t 50 1 órán át 1,1 liter 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az oldószert és a sav fölöslegét lepároljuk, és a kapott olajos maradékról két ízben friss tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradékot nagymennyiségű éterrel kezelve megszilárdítjuk. Az így kapott szilárd HC1.H-55 -Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, 25,6 g (46 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH, 10,6 g (92 mmól) HOSu, 10,9 g (53 mmól) DCC és 540 ml dimetil-formamid elegyét 1 órán át 0 C°-on, majd 48 órán át 25 C-on keverjük. Az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a 60 rendszerhez időről-időre Et3N-t adunk (összesen körülbelül 16 ml ETyN-t adagolunk be). A kivált oldhatatlan melléktermékeket leszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott nyersterméket kloroformban oldjuk, az oldatot vízzel háromszor mossuk, vízmentes nátrium- 65 szulfát fölött szárítjuk, végül szárazra pároljuk. A mara-3
