183765. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kacsa-hepatitisz elleni liofilizált vakcina előállítására
1 183 765 2 A találmány tárgya eljárás kacsa-hepatitisz elleni liofilizált vakcina előállítására az Asplin által kitenyésztett TN jelű attenuált hepatitisz-vírus felhasználásával. A kacsa-hepatitisz komoly veszélyt jelentő vírusos betegség, amelyre a kiskacsák életük első 4—5 hetében fogékonyak. Ha védekezés nem történik, egy-egy állomány szaporulatának 40—50%-a is elpusztulhat. Ezért keresték a védekezés módját és immunizálásra alkalmas vakcinát dolgoztak ki. A jelenleg használt vakcina előállításához az Asplin által kitenyésztett TN jelű csökkentett virulenciájú vírust alkalmazzák (Asplin F. D. és McLauchlan J. D. : Vet. Rec. 1954, 32, 66, 456; Asplin F. D.: Vet. Rec. 1956. 68, 412.). A vírust, amelynek titere legalább 104 EIDso/ml, 1:10 és 1:20 közötti hígításban tíznapos előkeltetett tyúktojás allanteisz-üregébe oltják, és a tojásokat időnként lámpával átvilágítva a 24. óráig elpusztult embriót tartalmazó tojásokat kiszedik és megsemmisítik. A vakcina előállítására azok a tojások alkalmasak, amelyekben az embrió a 24. és 96. óra között pusztult el. A tojások allantoamnion folyadékát (azaz az embriót körülvevő folyadékot) vákuum segítségével leszívatják, antibiotikummal kezelik és üvegekbe kiszerelik. Az eljárás kétségtelenül nagy haladást jelentett az egyre inkább nagyüzemi baromfitartás területén, a lenti vakcinának azonban hátrányai is vannak. Fő hátránya az, hogy folyékony, és fagyasztva kell tárolni —20 °C-on vagy ennél alacsonyabb hőfokon. így az anyag maximálisan fél évig tárolható. A fagyasztott vakcina szállítása során sok a törés, ezért inkább kézbesítővel juttatják a rendeltetési helyre. Felolvasztás után (a kiadástól számítva) a vakcina +4 °C- on 7 napig tárolható. A vakcina megfelelő, ha titere eléri a 103-5 EID5o/ml értéket. Saját kísérleteink szerint ez a vakcina nem liofilizálható, bár számos védőanyaggal kísérleteztünk. A liofilizálás okozta vírusveszteség túl nagy, a liofilizált anyag biológiai aktivitás már nem megfelelő. Emellett a vakcina termelése tekintélyes anyagfelhasználással jár: 100 liter vakcina előállításához 23 000 db előkeltetett tyúktojás szükséges. A találmány feladata olyan eljárás kidolgozása volt, amellyel kevesebb nyersanyaggal magasabb titerű, liofilizálható, hosszabb ideig tárolható és — száraz állapotának köszönhetően — exportálható vakcinát lehet előállítani. Az eljárás kidolgozása során abból indultunk ki, hogy az előkeltetett tyúktojásban szaporodó vírus előfordulási mennyisége nem azonos a tojás különböző pontjain (Hwang J. és Dougherty E.: Avian Dis. 1964,79(8), 264). A vírus főleg a csirkeembrió testében, különösen a májban dúsul fel, míg pont az allantoamion folyadék — az anyag, amelyből a vakcinát nyerik — a legkevesebb vírust tartalmazza. A fenti feladat megoldására eljárást dolgoztunk ki kacsahepatitisz ellen liofizált vakcina előállítására az Asplin által kitenyésztett TN jelű attenuált hepatitisz-vírus felhasználásával. A talál , .lány értelmében az Országos Közegészségügyi Intézet Törzsgyűjteményében 00220 szám alatt letétbe helyezett vírust előkeltetett SPF tyúktojások allantioszüregébe fecskendezzük, a tojásokat 37 °C körüli hőmérsékleten inkubáljuk, a 24. és 96. óra között elpusztult embriókat összegyűjtjük, adott esetben keményebb részeiket steril körülmények között eltávolítjuk, utána az embriókat 07—1,1%-os, előnyösen fiziológiás konyhasó-oldattal homogenizáljuk, centrifugáljuk, a tiszta szuszpenzióhoz antibiotikumot adunk, és a steril vírusanyagot védő- és vázképzőanyagok adagolása után önmagában ismert módon liotílizáljuk. Az SPF tojáson (specific patogen free) itt olyan tojást értünk, amely az Avian encehalomyelitis, baromfipestis, EDS, Bronchitis. Leucosis A—B, Gumboro, Marek, Reo v Tustól, valamint Salmonella Gall., Salmonella ty phy murium, Mycoplasma Gall, Mycoplasma Synoviaetől, illetve ezek ellenanyagaitól mentes. Homogenizálás közben a szuszpenziót előnyösen annyira hígítjuk, hogy az anyag 25—25 tf% embrióból és 75—65 tf% fiziológiás konyhasó-oldatból áll. Különösen előnyös, ha védő- és vázképző anyagként poli vinilpirrolidon, zselatin, glukóz és szacharóz kombinációját alkalmazzuk. Liofilizáláskor előnyösen úgy járunk el, hogy a liofilizáló gép anyagtartó polcait 0 °C és —6 °C közötti hőmérsékletre előhűtjük, a polcokra helyezett anyagot —30 °C és - -40 °C közötti hőmérsékletre lehűtjük, az anyagban lévő vizet vákuum alatt szublimáltatjuk, majd a szublimálás befejeztével apolcokat +30 °Cés +40 °C közötti hőfokra futjuk, s így az anyagot 4—10 órán át szárítjuk. Az eljárás során úgy járunk el, hogy a vírust hígítva juttatjuk a 10 napos előkeltetett SPF tojás allantoisz-üregébe, mégpedig tojásonként mintegy 10 000 EID50 dózisban. Az oltás utáni első 24 órán belül elpusztult embriókat megsemmisítjük. A tojásokat naponta átvilágítjuk, a48., 72. és 96. órában összegyűjtjük az elpusztult embriót tartalmazó tojásokat és felhasználásig +4 °C-on tároljuk. Az embrió fejének elülső részét (szemét, csőrét) célszerűen eltávolítjuk steril körülmények között, a csőrt azért, mert kemény, a szemeket azért, mert elszínezik a vakcinát. Az embriókat turmix géppel összezúzzuk, majd fiziológiás konyhasó-oldat hozzáadása mellett ultrahomogenizátorban (például ultraturrax gépben) tovább homogenizáljuk. A szuszpenzió összmennyiségére számítva körülbelül 50—80 tf% konyhasó-oldatot tartalmaz. A szuszpenziót 2000—3000 perc'1 fordulatszám mellett 20 percig centrifugáljuk, majd négyrétegű gézen keresztül szűrjük a feltisztult középső részt, míg a centrifugapohár alján levő csontmaradványokat és az anyag tetején úszó tollkezdeményeket eltávolítjuk. A szűrt anyagot tisztasági próbához táptalajra kenjük és antibiotikummal (penicillin, sztreptomicin, neomicin, klorocid) kezeljük. Amennyiben az anyag bizonyos idő elteltével fertőzöttnek bizonyulna, gentamicint adunk hozzá. A steril vírusanyagot az aratástól számított 5—6 napon belül liofilizáljuk, addig +4 °C-on tároljuk. A liofilizálás előtt vázképző- és védőanyagokat adunk a vírus-szuszpenzióhoz. Előnyös például az alábbi kombináció: 5% 10 tf% kollidon-oldat (polivinil-pirrolidon), 5% 10 tf%-os zselatin-oldat, 4% 50 tf%-os glukóz-oldalt, 3% 50 tf%-os szacharóz-oldat. A liofilizálást önmagában ismert módon végezzük, amire a kiviteli példák ismertetése során még kitérünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
