183765. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kacsa-hepatitisz elleni liofilizált vakcina előállítására
1 183 765 2 A tojásoltó törzsvírust hasonló módon állítjuk elő, mint a vakcinát, de itt maximálisan törekedni kell a csíramentességre, mert a tojásoltó vírushoz antibiotikum nem adható. A liofilizált vakcina +4 °C-on minden további nélkül egy évig tárolható, bár a magyar egészségügy —20 °C-on g történő tárolást ír elő. A kiadástól számítva 1 hónapig tartható +4 °C-on. Tekintettel arra, hogy a vírus-szuszpenzió liofilizálás előtti titere legalább egy nagyságrenddel magasabb, mint a technika állását képező fagyasztva tárolható vakcináé, az előállítandó mennyiség az eddiginek egy tized i q részére redukálódik. Ebből adódóan sokkal kevesebb tojás kerül felhasználásra, pedig az előkeltetett tojásnak ára az önköltség mintegy 95%-át teszi ki. Tekintélyes munkaerő megtakarítás is jelentkezik. A vírustitertől függően a 2 ml-es fiola hígításával ^5 100—1000 egyszeri adag nyerhető, mégpedig az alábbi összefüggés szerint: Titer Adagok száma Hígításhoz szükséges mennyiségű puffer naposkacsák tojókacsák 20 105 EIDso/ml 100 10 ml 100 ml 105-3 EID5o/ml 200 20 ml 200 ml 105-7 EIDso/ml 500 50 ml 500 ml 106 EIDso/ml 1000 100 ml 1000 ml Mind a tojókacsa, mind a naposkacsa adagja legalább 2000 EID50, ami — a különböző hígítás következtében — a naposkacsa esetén 0,1 ml, a tojó esetén 1 ml vakcinát je- 30 lent. A vakcinát oltással vagy— napos kacsák esetében — itatással alkalmazhatjuk. Ajánlatos a tenyészállományt kétszer oltani a tojásrakás megkezdés előtt. A tojókacsák sziken keresztül továbbadják az immunitást a naposkacsáknak, de az így szerzett védettség csak kb. 14 napig tart, ezért 35 a kiskacsákat is kezelni kell. Ha a vakcinát ivóvízben adjuk, ajánlatos az állományt pár órán keresztül szomjaztatni és csak utána adni a vakcinás vizet. Az állatok mozgatásával biztosítani kell, hogy minden kacsa ihasson, és olyan itatót kell használni, amelyben a kacsák nem tudnak fürödni. 40 A találmányt az alábbi példákkal közelebbről megvilágítjuk. 1. példa A vakcina előállítása és liofilizálása 45 10 napig előkeltetett SPF minőségű embrionált tyúktojásokat átvilágítjuk, a héjon megjelöljük a légkamra határát és az embrió helyét, majdatojás tompa végét fertőtlenítjük. A tojásoltó vírus steril fiziológiás konyhasó-oldattal készített szuszpenzióját a légkamra felett készített nyíláson át az 50 allantoisz-üregbe juttatjuk, amikoris a miiliterenként körülbelül 50 000 EID50 vírusmennyiséget tartalmazó anyagból tojásonként 0,2 ml-t használunk fel. Utána a nyílást paraffinnel elzárjuk és a tojásokat 37 °C-os keltetőgépben inkubáljuk. Az első 24 óra alatt elpusztult, vala- 55 mint a 96. órában még élő embriókat megsemmisítjük. A tojásokat naponta átvilágítjuk, és az elpusztult embriót tartalmazó tojásokat felhasználásig +2 °C és +5 °C közötti hőmérsékleten tároljuk. Az embriókat steril körülmények között összegyűjtjük, ollóval a fej elülső részét levágjuk, majd az embriókat turmix géppel összezúzzuk, és fiziológiás konyhasó-oldattal felhígítva ultralux homogenizátorral még jobban felaprítjuk. Az embriózúzalékot tovább hígítjuk, míg a kapott szuszpenzió 70% fiziológiás konyhasóoldatot tartalmaz. Ezt a szuszpenziót 3000 perc1 fordulatszám mellett 20 percig centrifugáljuk és a felülúszó részt 4 réteg steril gézen át szűrjük. Az így nyert anyaggal tisztasági vizsgálatot végzünk, majd közvetlenül utána 1 liter vírusszuszpenzióra számítva 200 000 NE (0,125 g) penicillint, 700 000 NE (1 g) sztreptomicint, 300 000 NE (0,5 g) neomicint és 1,2 g klorocidot adunk a szuszpenzióhoz. Az antibiotikumot nem oldjuk fel, hanem száraz por alakjában adagoljuk. Az antibiotikum hozzáadása után a szuszpenziót szobahőmérsékleten egy órán át állni hagyjuk, utána aerob és anaerob baktériumok, valamint gombák kimutatására alkalmas táptalajra oltjuk. Amennyiben a szobahőmérsékleten, illetve termosztátban tartott táptalajon 3 nap alatt mikroorganizmusok növekedése nem indul meg, az anyag sterilnek számít. Ha fertőzöttnek bizonyulna, 1 liter szuszpenzióra számítva 0,3 g gentamicint adunk hozzá. A szuszpenziót minél gyorsabban, legkésőbb az aratástól számítva 5—6 napon belül liofilizáljuk, addig +4 °C-on tároljuk. Liofilizálás előtt az alábbi steril védőanyagot adjuk a szuszpenzióhoz: 5% 10 tf%-os kollidon-oldat, 5% 10 tf%-os zselatin-oldat, 4% 50 tf%-os glukóz-oldat, 3% 50 tf%-os szacharóz-oldat. A védő- és vázképző anyagok összmennyisége 17 %. Liofilizálás előtt meghatározzuk a szuszpenzió titerét: 107 EID5o/ml. A vírusszuszpenziót2 ml-es adagokban üvegekbe töltjük és a liofilizáló gép —5 °C-ra előhűtött anyagtartó polcaira helyezzük. Amikor az anyag hőmérséklete —45 °C-ra lecsökkent, bekapcsoljuk a vákuum-szivattyút. Amikor a nyomás 0,1 mbar-ra csökkent, bekapcsoljuk az anyagtartó polcok fűtését és úgy szabályozzuk be, hogy az anyag hőmérséklete —30 °C és —35 °C között legyen (0,1 mbar esetén ehhez kb. —15 °C polchőmérséklet kell). A szublimálás befejeztével a polcokat +35 °C-ra felfűtjük, és a maximális vákuumot kapcsoljuk, hogy az anyag minél jobban víztelenedjék. Nyolcórás szárítás után a termék maradék-víztartalma 2 % alatti érték. Az üvegeket még a liofilizáló gépben vákuum alatt eldugaszoljuk, és a gumidugót fémből álló zárósapkával védjük. 2. példa Az oltóvírus előállítása Az 1. példában leírtak szerint járunk el azzal a különbséggel, hogy a szuszpenzióhoz nem adunk antibiotikumot, és a kész vakcinát nem liofilizáljuk, hanem mélyfagyasztva folyékony nitrogénben tároljuk. Titere legalább 106,5—107 EIDso/ml. Felhasználás előtt a tojásoltóból 1:60 — 1:200 arányú hígítást készítünk, amelynek 0,2 ml-je mintegy 10 000 EID50 vírust tartalmaz. A tojásoltó vírus nem hemagglutinálhatja a tyúk vörösvérsejteket. 3
