183590. lajstromszámú szabadalom • Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható étvágyszabályozó hatású hatóanyag elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból
1 183590 2 pufferként előnyösen 0,02 mól koncentrációjú trisz-hidroklorid (2-amino-2-hidroximetil-1,3-propándiol-hidroklorid) oldatot alkalmazunk, amely 0,5—1,0 mól/1 nátrium-kloridot és előnyösen kis mennyiségű (1,0 millimól körüli) Ca2+ és Mn2+ iont is tartalmaz. Az induló pufferoldatban a viszonylag magas sókoncentráció azért szükséges, hogy ne jöhessen létre nemspecifikus fehérje-kötés az adszorbens és a kísérő fehérje-jellegű anyagok között. Az induló pufferoldatban feloldott anyagot azután felvisszük az adszorbens-gél (előnyösen Con-A-Sepharose) oszlopra, amelyet előzőleg egyensúlyba hoztunk az induló pufferoldattal, ami oly módon történhet, hogy az oszlopot saját térfogatának legalább tízszeresét kitevő mennyiségű pufferoldattal mossuk. A tisztítandó szatietin-terméknek az oszlopra való felvitele után az eluálást alfa-metil-mannozidot emelkedő koncentrációban tartalmazó pufferoldattal végezzük. Célszerűen 0,5 mól/1 koncentrációjú alfa-metil-mannozidot tartalmazó oldatot csepegtetünk folyamatosan az induló pufferoldat összetételével egyező eluáló oldatba és az elegy folyamatos keverésének biztosítjuk a lineáris grádiens-képződést. Az eluáló oldat alfa-metil-mannozid-koncentrációja tehát lineárisan emelkedik az eluálás során; az oldat ion-koncentrációját és pH-értékét az eluálás során nem változtatjuk. A Con A-Sepharose oszlopon végzett affuzitási kromatográfia regisztráló fotométerrel 254 nm hullámhosszon felvett elúció-diagramját a 2. ábra szemléleti; a diagramon az ordinátán az extinkció, az abszcisszán pedig a csőszám van feltüntetve. Amint az ábrán látható, a kísérő anyagokat tartalmazó anyagkeverék az oszlopon áthalad és 1. csúcsként az áttörőfrakciókban jelenik meg, míg az oszlopon megkötődött glükoproteid lényegesen nagyobb retenciós értékkel, a megközelítően szimmetrikus 2. csúcs alakjában eluálódik a grádiens alfa-metil-mannozid-koncentráció növekedésének eredményeként. Az oszlopról így eluált biológiailag aktív hatóanyagot a megfelelő frakciók egyesítése és betöményítése útján kapjuk meg; minthogy az eluátum-frakciókból így kapott anyag még a pufferoldatból származó sókat, alfa-metil-mannozidot és a nagy molekulasúlyú hatóanyagból esetleg leszakadó kis molekulasúlyú fragmenseket is tartalmaz, ebből a termékből a tiszta hatóanyagot egy utolsó gél-kromatografálási művelettel választjuk el. Ezt a műveletet egy 3000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gél-oszlopon, célszerűen „Bio-Gel P—2” gélen végezzük, ionmentes vízzel, E gél-kromatográfiai művelet során az említett sók és egyéb kis molakulasúlyú anyagok kis molakulaméretük folytán belépnek a gél belsejébe és így retardálódnak; a tiszta, sómentes szatietin viszont kizáródik a gél-oszlopon és az oszlop-térfogat egyharmadának megfelelő elúciós térfogattal jelenik meg. A tiszta ionmentes vízzel kapott hatóanyagtartalmú frakciókkal egyesítjük és liofilizáljuk; így fehér por alakjában kapjuk a most már teljesen tiszta és egységes szatietin hatóanyagot. A szatietin hatóanyagnak az emberi vagy állati vérszérumból kiinduló teljes kinyerési és tisztítási eljárását, az egyes közbenső termékek és a végtermék anyagmennyiségeinek a feltüntetésével, az 1. ábrán vázolt folyamatábra szemlélteti. Amint ebből a folyamatábrából is kitűnik, 1 liter emberi vérszérumból körülbelül 1,5 mg liofilizált szatietin-hatóanyagot lehet elkülöníteni, amelynek biológiai aktivitása 100 Sz. E./mg körül van. A találmány szerinti eljárással elkülönített tiszta szatietin-hatóanyag SDS-gél-elektroforézises módszerrel meghatározott molekulasúlya a 60000—70000 dalton tartományába esik; az anyag poliakrilamidgélben, 5—7 illetőleg 7—9 pH-értékű amfolin jelenlétében történő futtatással, azaz izoelektromos fókuszálással meghatározott izoelektromos pontja pl = 7,0—7,1-nek adódott; a termék savas hidrolizátumának analízise az alábbi összetételt mutatta: fehérjetartalom 25% szénhidráttartalom 60% kötött víztartalom 5—10% A 25% fehérjetartalom aminosav-analízise: Asp 2%, Thr 0,85%, Ser 0,97%, Glu 1,49%, Gly 0,32%, Alá 1,15%, Val 0,30%, Tyr 2,19%, Lys 9,50%; összes aminosav: 18,77%; glükózamin: 6,15%. A 60% szénhidráttartalom megoszlása: fukóz 12%, mannóz 13%, galaktóz 11%, glükóz 24%. Tekintettel arra, hogy a fenti elemzési adatok liofilizált termékre vonatkoznak, a készítmény víztartalma a liofilizálás körülményeiből függően változó lehet és a fenti kötött víztartalom mellett változó mennyiségű szabad víz is lehet a liofilizált termékben. A szatietin-termék nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél-elektroforézis, grádiens poliakrilamid gélelektroforézis és affinitási kromatográfiai szeparálás, valamint analitikai izoelektromos fókuszálás során mutatott viselkedése egyaránt az anyag kémiai homogenitását mutatja. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját közelebbről az alábbi példa szemlélteti. Példa a) 3000 ml humán szérumot Amicon UM—10 membránon állandó keverés közben, 3—4 atm. nyomás alkalmazásával átszűrtünk. A kapott, mintegy 2000 ml ultraszűrletet vákuumban 60 ml térfogatra betöményítjük. A csapadékos koncentrátumot 9000 g-vel 30 percig centifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot elkülönítjük, keverés és hűtés közben cseppenként hozzáadunk 12 ml 55%-os triklórecetsavat és az elegyet 5—10 °C hőmérsékleten 1 óra hosszat állni hagyjuk. A kicsapódott fehérjék eltávolítása végett az elegyet 5 °C körüli hőmérsékleten 30000 g-vel ultracentrifugáljuk, míg optikailag teljesen tiszta szupernatáns folyadékot nem kapunk. Ezt a folyadékot egy 5,90 cm méretű Sephadex G—15 oszlopon kromatografáljuk, majd 0,1 mólos ammónium-acetát-pufferoldattal (pH = 6,6) eluálunk. Az 500 és 600 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A liofilizált maradékot 10 ml desztillált vízben oldjuk és egy 2,5-90 cm méretű Bio-Gel P—2 gél-oszlopra visszük. Az oszlopot desztillált vízzel eluáljuk és a 130 és 180 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 25—30 mg nyers, sómentes szatietint kapunk, sárgásfehér por alakjában. b) 30 mg fenti módon kapott nyers termékből desztillált vízzel 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készí5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
