183590. lajstromszámú szabadalom • Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható étvágyszabályozó hatású hatóanyag elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból
1 183590 2 tünk, ezt az oldatot 2 cm széles és 30 cm hosszú sávba felcsepegtetjük egy Whatman 3M papírra, a papírt megszáritjuk, majd 6,2 pH-értékű elektród-pufferrel (10 tf./tf.°7o piridin, 0,5 tf./tf.Wo ecetsav) egyenletesen megnedvesítjük és a futtatást folyamatosan hűtött horizontális készülékben 20 V/cm feszültség-grádienssel végezzük 4 órán át. Az elektroforézis befejezése után a papírt megszárítjuk és egy 1 cm-es csíkot ninhidrinnel, illetve esetenként perjódsavas Schiff reagenssel megfestünk a szeparálódott komponensek detektálása céljából. A papírt ezután feldaraboljuk és az elkülönített részekből a hatóanyagot desztillált vízzel kioldjuk. Liofilizálás után mintegy 20—23 mg 50—100 Sz. E./mg aktivitású tisztított terméket kapunk. c) A fenti módon kapott és elektroforézissel tisztított termék 20 mg-ját 4 ml 7,0 pH-értékű induló pufferoldatban (összetétele: 0,02 ml/1 trisz-hidroklorid, 0,5 mól/ml nátrium-klorid, 0,001 mól/1 kalcium-klorid és 0,001 mól/1 mangán-klorid) oldjuk és az oldatot felvisszük egy 1,7 cm átmérőjű és 37 cm hosszú, Con- A-Sepharose adszorbenssel töltött és a fenti induló pufferoldat közepes oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségével átmosott oszlopra. A grádiens-eluálást 100 ml fenti összetételű induló pufferoldattal indítjuk meg és ehhez állandó keverés közben hozzácsepegtetünk 100 ml ugyanilyen összetételű, de 0,5 mól/1 alfametil-mannozidot is tartalmazó pufferoldatot. így az eluáló-oldat alfa-metil-mannozid tartalma az eluálás folyamán 0 mól/l-ről fokozatosan 0,5 mól/l-ig emelkedik. Az eluálást 254 nm-nél folyamatosan regisztráló UV monitorral ellenőrizzük; 2,5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk össze és a kívánt terméket tartalmazó, 75 ml és 100 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizálással 10 ml térfogatra besűrítjük. Az így kapott koncentrált folyadékot az oldatban jelenlevő sók és egyéb kismolekulájú szennyezések eltávolítása céljából egy 2,5 cm átmérőjű, 90 cm hosszú Bio-Gel P—2 oszlopra visszük, majd az oszlopot ionmentes vízzel eluáljuk, a 140 ml és 180 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 5—6 mg hófehér, sómentes, homogén, 100 Sz. E./mg aktivitású szatietint kapunk. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható étvágyszabályozó hatóanyag elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból 50000 molekulasúlyig átengedő membránszűrőn való átszűrés, a szűrlet bepárlása és gél-kromatográfiás továbbfeldolgozása útján, azzal jellemezve, hogy az emberi és/vagy állati vérszérum membránszűrőn történő átszűrése út- 5 ján kapott szűrletet részlegesen bepároljuk és a kapott koncentrátumból az oldhatatlan részt — célszerűen centrifugálással — eltávolítjuk, majd a folyadékfázishoz 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékleten 5—25 súly/tf.%, célszerűen 10—12 súly/tf.% koncentráló cióig triklórecetsavat adunk, a kicsapódott fehérjéket — célszerűen ultracentrifugálással — eltávolítjuk, a kapott oldatot 4000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, 0,5—1,0%-os, előnyösen 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal vagy 6,0—7,0 pH-15 tartományú foszfát-pufferoldattal eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat liofilizálással koncentráljuk, majd 3000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen újból kromatografáljuk, vízzel eluálva frakcionáljuk, az aktív frakciókat liofilizáljuk és a kapott nyers termé- 20 két kívánt esetben további, célszerűen elektroforézises tisztításnak vetjük alá. (Elsőbbség: 1981. 09. 28.) 2. Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható étvágyszabályozó hatóanyag elkülönítésére em- 25 béri és/vagy állati vérszérumból 50000 molekulasúlyig átengedő membránszűrőn való átszűrés, a szűrlet bepárlása és géi-kromatográfiás továbbfeldolgozása útján, azzal jellemezve, hogy az emberi és/vagy állati vérszérum membránszűrőn történő átszűrése út- 30 ján kapott szűrletet részlegesen bepároljuk és a kapott koncentrátumból az oldhatatlan részt — célszerűen centrifugálással — eltávolítjuk, majd a folyadékfázishoz 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékleten 5—25 súly/tf.%, célszerűen 10—12 súly/tf.°/o koncentrá- 35 cióig triklórecetsavat adunk, a kicsapódott fehérjéket — célszerűen ultracentrifugálással — eltávolítjuk, a kapott oldatot 4000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, 0,5—1,0%-os, előnyösen 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal vagy 6,0—7,0 pH-40 tartományú foszfát-pufferoldattal eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat liofilizálással koncentráljuk, majd 3000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen újból kromatografáljuk, vízzel eluálva frakcionáljuk, az aktív frakciókat liofilizáljuk, a kapott nyers terméket 45 6,0—6,5 pH-értékű pufferoldatban elektroforézises szeparálással tisztítjuk, a kiindulási helyzetben maradó főterméket elkülönítjük és a glükopiranóz és/vagy mannopiranóz-csoportok iránt specifikus affinitást mutató adszorbens gél alkalmazásával affinitási kro- 50 matográfiai elválasztásnak vetjük alá. 2 db ábra 5
