183590. lajstromszámú szabadalom • Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható étvágyszabályozó hatású hatóanyag elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból
1 183 590 2 tatlanul nagyobb, mint a szeparálódott szatietin mennyisége, ebből következően ez a tisztítási lépés nagyságrendekben kifejezhető tisztulást jelent a szatietin javára. A fehérjementesítéshez használt triklórecetsav, mint kisebb molekulájú anyag, retardálódik a géloszlopon és így só- és savmentes hatóanyagot kapunk az oszlop-térfogat 1/3-ának megfelelő elúciós (kizárási) tartományban. Ezeket a frakciókat egyesítjük és liofilizálással bekoncentráljuk. A következő tisztítási lépés is gélkromatográfia, amelyet azonban 3000 molakulasúly alatti kizárási térfogatú gélen, célszerűen Bio-Gel P—2 oszlopon, desztillált vizes közegben végzünk. E tisztítási lépés eredményeként a termékben még jelenlévő sókat és egyéb kismolekulasúlyú fragmenteket (töredék peptidek stb.) távolítjuk el. A szatietin-aktivitású frakciók jelen esetben is kizáródnak a gélből és az oszlop-térfogat 1/3-ának megfelelő elúciós térfogattal jelennek meg. A hatóanyagot a frakciók egyesítése és liofiüzálása után jól kezelhető halványsárgás-fehér por formájában kapjuk. így 1 liter emberi vérszérumból, illetőleg az ebből nyerhető 2/3 liter ultraszűrletből kiindulva 8—10 mg liofilizált terméket kapunk. A fenti eljárással előállított nyers szatietin standard nyersterméknek tekinthető, amely azonban gyakorlati célokra, tehát étvágyszabályozószerként való felhasználásra már ebben az alakban is megfelelő tisztaságú, szatietin-aktivitása 25—50 Sz. E./mg. A termék szatietin-aktivitását az általunk kidolgozott biológiai értékmérési módszerrel mérjük; 1 szatietin-egységen (Sz. E.) azt a hatóanyag-mennyiséget értjük, amely 96 óra hosszat éheztetett 200—240 g súlyú CFY nőstény patkányoknak intracerebroventrikulárisan beadva a standard tápdugó fogyasztását a táplálékadás első napján az átlagos 24,04±0,76 g-ról 10 g-ra csökkenti. A fent leírthoz hasonló módon nyerhető ki a nyers szatietin állati (szarvasmarha, ló, nyúl, patkány) vérszérumból is; bár a kapott termék hozama és hatáserőssége eltérő lehet (például szarvasmarha-vérszérumból ugyanezzel az eljárással valamivel több — 1 liter vérszérumból 10—13 mg — a humán eredetű termékkel azonos aktivitású nyers szatietint kapunk), a hatás specifikus jellege és szelektíven a táplálkozási mechanizmusra irányuló volta mindenfajta eredetű terméknél egyaránt megmutatkozik. A fenti módon kapott, 25—50 Sz. E./mg aktivitású nyers szatietin nátrium-dodecil-szulfát (SDS) poliakrilamid gél-elektroforézissel meghatározva 50—70000 dalton molekulasúlyúnak mutatkozó, sómentes, albumint gyakorlatilag már nem tartalmazó, alacsony (5—25%) fehérjetartalmú, 60—90% szénhidrátot tartalmazó, liofilizált állapotban sárgásfehér porszerű termék, amely szénhidrát-részében 4 számottevő cukorkomponenst, fukózt, mannózt, galaktózt és glükózt tartalmaz. A hidrolizált termékben számottevő mennyiségű glükóz-amin minden esetben kimutatható volt. A termékben nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézissel és analitikai izoelektromos fokuszálással vizsgálva 4—6 fehérjefestéssel kimutatható sávot (komponenst vagy alegységet) lehet kimutatni. Középfeszültségű papír-elektroforézissel 6,2 illetőleg 1,6 pH-értékű pufferoldatban vizsgálva a termék még összetett anyagnak mutatkozik; a biológiailag hatásos főkomponens a kiinduló helyzetben marad vagy alig mozdul el a katód irányában. Az elektroforézises futtatás után a hatóanyag ninhidrines vagy perjódsavas Schiff-festéssel egyaránt detektálható, ami szintén az anyag glükoproteid-természetére utal. A fenti módon kapott nyers szatietin elektroforézises módszerekkel, laboratóriumi méretben célszerűen papír-elektroforézissel tisztítható tovább. A 6,2 pH- értékű pufferoldatban lefolytatott papír-elektroforézises szeparálás során 75% körüli hozammal különíthető el a kiindulási helyzetben maradó főtermék (Rr = 0,1), míg két fehérje-jellegű, illetőleg glükoproteid-tartalmú kísérő komponens az anód irányában mozdul el és így teljesen elválasztható a nagy (60—100 Sz. E./mg) aktivitású, ninhidrinre és perjódsavas Schiff-festésre pozitív főterméktől. Az így elkülönített hatóanyag már nagy tisztaságú, az eddigi vizsgálati módszerekkel, például gél-kromatográfiával vagy grádiens poliakrilamid gél-elektroforézissel vizsgálva egységes viselkedést mutató, 100 SZ. E./mg-ot megközelítő aktivitású, lényegileg glükoproteid-jellegű termék, amely azonban — amint összetétel- és aktivitás-értékeinek némileg ingadozó volta is mutatja — kémiailag még nem tekinthető teljesen egységes, meghatározott állandó összetételű anyagnak. A kémiailag egységes szatietin-hatóanyag tiszta állapotban való elkülönítésére irányuló további vizsgálataink során azt találtuk, hogy ez a feladat is megoldható, ha a fenti módon elkülönített és elektroforézises módszerrel tisztított hatóanyagot a glükoproteidek elválasztására újabban kifejlesztett affinitási kromatográfiai módszerrel [vö. pl. D. M. Swallow, L. Evans, D. A. Hopkinson: Nature 269, 261—262 (1977)] még egy további elválasztási műveletnek vetjük alá. Ehhez az affinitási kromatográfiai művelethez adszorbensként az elkülönítendő anyag valamely, az eltávolítandó kísérőanyagokban elő nem forduló csoportját specifikusan megkötni képes anyagot kell alkalmazni; a glükoproteid-jellegűnek bizonyult szatietin esetében tehát a glükoproteidek glükopiranózcsoportjai iránt specifikus affinitást mutató adszorbenst alkalmazunk. A jelenleg ismert ilyen csoportspecifikus adszorbensek közül különösen a „Con-ASepharose” elnevezésű adszorbens-gél bizonyult erre a célra előnyösnek. Ez az adszorbens-gél, amelyben a cián-bromiddal aktivált Sepharose 4B-hez Concavalin A van kapcsolva, megfelelő műveleti körülmények között specifikusan köti meg az alfa-D-mannopiranozil-vagy alfa-D-glükopiranozil-csoportot tartalmazó molekulákat, míg az ilyen csoportokat nem tartalmazó kísérőanyagok (egyéb fehérjék, peptidek stb.) a gélből kizáródnak. Ezek a kizáródott anyagok az eluálás során az „áttörő” frakciókban jelennek meg, a gél-oszlop teljes térfogatának körülbelül egyharmadánál, míg a gélen megkötött glükoproteid-természetű anyagok adott esetben még a kötés természetétől, azaz a vegyület kémiai sajátosságaitól függően tovább is szeparálódhatnak, különösen ha grádiens-elúciót alkalmazunk a gélen megkötött termék eluálására. A találmány szerinti eljárás e lépésének, az affinitási kromatográfiai elválasztásnak a gyakorlati kivitele során az előzetes frakcionálási műveletekkel már messzemenően tisztított szatietin-terméket egy semleges kémhatású induló pufferoldatban oldjuk. Induló 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
