183590. lajstromszámú szabadalom • Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható étvágyszabályozó hatású hatóanyag elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból
1 183 590 2 A találmány tárgya új eljárás egy specifikusan a táplálkozási központra ható, étvágyszabályozó hatású hatóanyag elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból. A 178703 sz. magyar szabadalmunk leírásában eljárást ismertettünk egy specifikusan a táplálkozási központra ható, étvágyszabályozó hatású frakció elkülönítésére emberi és/vagy állati vérszérumból. Az ott leírt eljárás szerint az emberi és/vagy állati vérszérumot egy 50000 molekulasúlyig átengedő membránszűrőn átszűrtük, a szűrletet bepároltuk, a maradékot vízben oldottuk, az oldatot 50000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáltuk, 0,1— 1,0% nátrium-kloridot tartalmazó, semleges kémhatású vizes oldattal eluálva frakcionáltuk, a biológiai aktivitást mutató frakciókat bepároltuk, a maradékot a szükséges mennyiségű vízben oldottuk, az oldatot újból egy 50000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáltuk, vízzel eluálva frakcionáltuk és a biológiai aktivitást mutató frakciókat bepároltuk. Ily módon egy hidrolízissel aminosav- és cukorkomponensekre bontható (összetétele körülbelül 60% aminosav és 10% cukor), glikoproteidnek mutatkozó hatékony frakciót különítettünk el, amely igen hatásos és specifikusan a táplálkozási központra ható, a központi idegrendszerre sem depresszív, sem serkentő hatást nem mutató étvágyszabályozó hatóanyagnak bizonyult. E találmány továbbfejlesztéseként azt találtuk, hogy a fenti eljárással kapott hatékony frakció az általunk további kutatásaink során kidolgozott és a jelen találmány tárgyát képező új eljárással tovább bontható és ily módon olyan, az idézett módon elkülönített frakciónál mintegy háromszor-négyszer hatékonyabb termék állítható elő, amely kémiai összetétele szempontjából nemcsak lényegesen eltér az említett korábbi eljárással kapott hatékony frakciótól, hanem mind fizikailag, mind kémiailag tiszta, egységes, egyértelműen meghatározott összetételű anyagnak tekinthető. Felismertük ugyanis, hogy az említett korábbi eljárással elkülönített hatékony frakció fehérje, illetőleg peptid-tartalmának jelentős része kémiailag nem kötött vagy csak lazán kötött alakban, a szatietin-aktivitás szempontjából közömbös komponensként van jelen és megfelelő fehérje-lecsapási mószerekkel eltávolítható a tényleges hatóanyag mellől, ugyanakkor a még ezután is visszamaradó kisebbmolekulájú peptidjellegű és egyéb kísérőanyagok további, részben elektroforézises, részben affinitási kromatográfiai műveletekkel teljesen eltávolíthatók és így a tiszta, kémiailag egységes szatietin-hatóanyagot állíthatjuk elő. A találmány értelmében tehát az új, a korábban előállított hatékony frakció aktivitását többszörösen felülmúló, szelektíven a táplálkozási központra ható, kémiailag homogén, jói definiálható összetételű étvágyszabályozó hatóanyag, vagyis a tiszta szatietin az alábbi módon nyerhető ki az emberi vagy állati vérszérumból : Az emberi és/vagy emlős állatoktól származó vérszérumot 50000 dalton molekulasúlyig átengedő membránszűrőn átszűrjük, a szűrletet részlegesen bepároljuk és a kapott koncentrátumból az oldhatatlan részt — célszerűen centrifugálással — eltávolítjuk, majd a folyadékfázishoz 0 °C és +10 °C közötti hőmérsékleten 5—25 súly/tf.%, előnyösen 10—12 súly/tf. % koncentrációig triklórecetsavat adunk, a kicsapódott fehérjéket — célszerűen ultracentrifugálással eltávolítjuk, a kapott oldatot 4000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, 0,5— 1,0%-os nátriumklorid-oldattal vagy 6,0—7,0 pH- tartományú pufferoldattal eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat liofilizálással koncentráljuk, majd 3000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen újból kromatografáljuk, vízzel eluálva frakcionáljuk és az így kapott nyers terméket kívánt esetben elektroforézissel tovább tisztítjuk, majd affinitási kromatográfiával a tiszta hatóanyagot elkülönítjük. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitele során az első tisztítási műveletet, a membránszűrést, (ultraszűrést) például Amicon UM—10 membránon vagy Sartorius membránon, célszerűen 3 atm nyomás alkalmazásával, állandó keveréssel végezzük. A kapott szürletet vákuum-bepárlással bekoncentráljuk és preparatív centrifugán az oldhatatlan részt elkülönítjük. A kapott zavaros, de csapadékmentes oldatot 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékletre hűtjük és annyi triklórecetsavat adunk hozzá, hogy az elegy triklórecetsav-koncentrációja 5 súly/tf.% és 25 súly/tf.% között, előnyösen 10 súly/tf.% körül legyen. Az így csapadékossá vált elegyet 0 °C és 5 °C közötti hőmérsékleten legalább egy óra hosszat (előnyösen éjjelen át) állni hagyjuk, majd a kicsapódott fehérjéket ugyanilyen hőmérsékleten történő uitracentrifugálással elkülönítjük, amikoris tiszta, éles sárga színű oldatot kapunk. A triklórecetsavas kezelés eltávolítja az összes nagymolekulasúlyú szérum-fehérjéket, beleértve az albumint is. A nagy szénhidráttartalmú szatietin viszont nem csapódik ki, hanem oldatban marad annak ellenére, hogy kisebb mennyiségű fehérjét még tartalmaz. Ebből következik, hogy ez a fehérjetartalom már kémiailag kötött alakban lehet jelen, a szatietin szénhidrátrészhez kapcsolódva. A tisztítás következő lépéseként preparatív gélkromatográfiát alkalmazunk 4000 molekulasúly alatti kizárási térfogatú gél-oszlopon. Ezt a kromatográfiás tisztítást előnyösen Sephadex G—15, G—10 vagy G—25 géllel töltött oszlopon végezzük. Az elúcióhoz előnyösen 0,1 mól ammónium-acetát pH 6,6-os puffert használunk, mivel a kísérletek szerint ez biztosította legjobb hatásfokkal a szatietin-aktivitású frakciók elkülönítését és a puffer illékonysága révén gyakorlatilag sómentes terméket lehetett előállítani. A kromatográfiás célszerűen 0,9%-os fiziológiás nátrium-klorid-oldat vagy különféle foszfát pufferek is alkalmazhatók pH 6,0—7,0 tartományban. Az aktív frakció a géloszlop kizárási térfogatánál (V0, ahol Kd = 0; Kd a vizsgált anyag megoszlási együtthatója) jelenik meg, ami azt jelenti, hogy a termék molekuláinak mérete nagyobb, mint a gélszemcsék belső lyukátmérői, így nem tudnak behatolni a gél belsejébe, azaz kizáródnak a gélből és az eluenssel együtt a géloszlop térfogatának körülbelül egyharmadát jelentő eluens térfogatnál jelennek meg. így Sephadex G—15 gél esetében az 1500-nál nagyobb molekulasúlyú molekulák viselkednek így. A szérumból származó ennél kisebb molakulasúlyú anyagok viszont behatolnak a gél belsejébe és „retardálódnak” (ez esetben Kd>0). Miután az ultraszűrletben jelenlévő kismolekulasúlyú anyagok mennyisége a sókkal együtt összehasonlítha5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
