183579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az L-arginil-L-lizil-L-aszparagil-L-valil-L-triozin pentapeptid előállítására
1 183 579 2-L-valint (Z-Val-OH) diciklohexil-karbodiimid jelenlétében L-tirozin-metilészterrel (H-Tyr-OMe) reagáltatunk. A kapott (Z-Val-Tyr-OMe) védett dipeptidésztert [J. Ramachadran, C. H. Li: J. Org. Chem., 28, 173 (1963); H. Schwarz, F. M. Bumpus, I. H. Page: J. Am. Chem. Soc., 79, 5697 (1957); S. Sakakibara, M. Itoh: Bull. Chem. Soc. Japan, 40, 656 (1967)] lúggal elszappanosítjuk, és a Z-Val-Tyr-OH védett dipeptidről [R. Schwyzer és munkatársai: Helv. Chim. Acta, 41, 1273 (1958)] katalitikus hidrogénezéssel eltávolítjuk a benziloxikarbonil-védőcsoportot. A szabad dipeptidet [R. Schwyzer és munkatársai: Helv. Chim. Acta, 41, 1273 (1958)] benziloxikarbonil-L-aszparaginsav-(/?-terc-butilészter)-a-N-hidroxi-szukcinimidészterrcl (Z-Asp(O'Bu)-OSu) acilezzük. A védett tripeptidről ismét katalitikus hidrogénezéssel távolijuk el a védőcsoportot, majd a szabad tripeptidet a-benziloxikarbonil-(e-terc-butiloxikarbonil)-L-lizin-N-hidroxi-szukcinimidészterrel (Z-Lys(Boc)Osu) acilezzük. A védett tctrapcptidről ezután katalitikus hidrogénezéssel távolijuk el a védőcsoportot, és a szabad tetrapeptidet terc-butiloxikarbonil-L-arginin (Boc-Arg-OH) pivaloilkloriddal, klór-szénsav-etilvagy -izobutil-észterrel képezett vegyes anhidridjével acilezzük. A védett pentapeptidről egy lépésben trifluor-ecetsavval távolijuk el az összes védőcsoportot, és a szabad pepiidet acetátciklusba vitt, erősen bázisos ioncserélő gyantával kezeljük. Az igy kapott termék vékonyréteg-kromatográfiás,, elektroforézises és nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatok alapján 99,3%-os tisztaságú. Az eljárás előnye, hogy az említett mellékreakciókra vagy egyáltalán nincs lehetőség, vagy azok a minimumra szoríthatók vissza. így például az egyes lépések vékonyréteg-kromatográfiás ellenőrzése során nem tapasztaltuk a tirozin hidroxilcsoportjának acilezését [S. K. Girin, J. P. Svacskin: Zsur. Obscs. Him., 49, 451 (1979)], az aszparaginsav gyűrűzárását szukcinimidszármazékká. Az adott védőcsoport-kombináció eleve kizárja a benzilészter-tipusú kötések részleges acidolízisét, továbbá az arginin nitrocsoportjának nem szelektív eltávolításából adódó melléktermékek keletkezését. Az alkalmazott kapcsolási módok és a védőcsoport-kombináció lehetővé teszik olyan végtermék előállítását, melyet nem kell alávetni a nagy oldószer- és időigényes oszlopkromatográfiás tisztításnak. További előny jelentkezik a inéretnövclés és az ipari szintű gyártás vonalán. A szintézis során alkalmazott műveletek korlátlanul nagyíthatók, és a gyógyszeriparban általánosan alkalmazott készülékekben kivitelezhetők. Ez, az eljárás termelékenységének figyelembevételével, a TP—5 gazdaságos előállítását eredményezi. Az Arg-Lys-Asp-Val-Tyr pentapeptidet a találmány szerinti eljárásban acetát alakjában kapjuk. Ebből a bázis önmagában ismert módszerekkel szabadítható föl. A szabad bázis viszont savakkal reagáltatva gyógyászati célra alkalmazható savaddíciós sókká alakítható. E célra használhatunk szervetlen savakat, mint sósav, kénsav, foszforsavak, szerves savakat, mint hangyasav, hosszabb szénláncú zsírsavak, tejsav, borkősav, citromsav, maleinsav, valamint aminosavakat, mint aszparaginsav, glutaminsav stb. A találmány szerinti eljárással készült pentapeptid a szokásos gyógyszerkészítmények formájában kerülhet gyógyászati felhasználásra, ami azonban nem képezi a találmány tárgyát. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti pentapeptidet enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szerves vagy szervetlen vivőanyag kíséretében tartalmazzák. így a gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilizátumok, mikoris vivőanyagként a pepiiddel nem reagáló vegyületek, például mannit, tejcukor, keményítő jöhetnek számításba, lehetnek oldatok és szuszpenziók, valamint emulziók, melyek különböző, semleges, tartósító, stabilizáló segédanyagokat is tartalmaznak. Előnyösek azok a gyógyszerkészítmények, amelyek a pentapeptidet komplexek formájában tartalmazzák, mivel ez elhúzódó hatást nyújt a készítménynek. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példa szemlélteti. A példában az aminosav- és peptidszármazékok jelölésére használt rövidítések az IUPAC—IUB által ajánlottak [J. Bioi. Chein., 247, 977 (1972)]. Az aminosavak mind L-antipódok. Egyéb rövidítések: DCC= diciklohexil-karbodiimid, DCU=diciklohexilkarbamid, Z=benziIoxikarbonil, Boc=terc-butiloxikarbonil, 'Bu—terc-butil, OSu=N-szukcininűdoxi. Az olvadáspont-meghatározások dr. Tottoli-féle készülékben (Biichi, Svájc) történtek. A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokat előregyártott kovasavgél adszorbensen (DC-Fertigplatten, Merck) végeztük az alábbi oldószerelegyekben : 1. etil-acetát: (piridin :ecetsav:víz=20:6:11) = 9:1 2. etil-acetát: (piridin:ecetsav:víz"=20:6:11)=4:1 3. etil-acetát: (piridin :ecetsav:víz= 20:6:11) = 7:3 4. etil-acetát: (piridin : ecetsav :víz= 20:6:11 ) == 1:1 5. etil-acetát: (piridin:ecetsav:víz= 20:6: ll)—2:3 6. etil-acetát: (piridin : ecetsav : víz= 20 :6:11)=*3:7 A kromatogramok előhívását ninhidrinnel, valamint klórozás után KJ-tolidinnel végeztük. A fajlagos optikai forgatóképesség mérése Perkin Elmer 141 számkijelzésű fotoelektromos polariméteren történt. A peptidek tirozintartalmának meghatározása 0,1 mól/I-es NaOH-oldatban történt 294 nm hullámhosszon Pye-Unicam SP 1800 UV-spektrofotométerrel. A Boc-Arg(HCL) -Lys (Boc)-Asp (OBu)-Val-Tyr-OH nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatát Hewlett-Packard 1081A szivattyúból, Schoeffel SF 770 típusú, változtatható hullámhosszú detektorból, Rheodyne 7010 loop-injektorból és KUTESZ „Type 185” írószerkezetből álló készülékkel végeztük 250x4,6 mm-es Nucleosil 10 Cig (Chrompack B. U., Hollandia) oszloppal, 1,08 ml/perc áramlási sebességgel, 210 nm hullámhosszon. Eluensként metanol, acetonitril és pH 2,2-es Me llvaine puffer 5:1:4 arányú elegyét használtuk, az elegy 0,1 mól/1 NaC104-ot tartalmazott. Az Arg-Lys-Asp-Val-Tyr és savaddíciós sóinak nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatát egy Liquopump 312 nagynyomású pumpából, Liquodet 308 változtatható hullámhosszú detektorból (Labor MIM, Budapest), 20 //1-es loop-injektorból és Varian A—25 típusú írószerkezetből álló készülékkel végeztük egy 250x4,6 mm-es Lichrosorb RP—18 10/tm oszlopon (Applied Science Láb., USA) 1,0 ml/perc áramlási sebességgel 275 nm hullámhosszon. Eluensként acetonitril és pH 2,2-es Mc llvaine puffer 1:9 arányú elegyét használtuk. A vizsgálandó anyagból 1%-os vizes oldatot készítettünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
