183579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az L-arginil-L-lizil-L-aszparagil-L-valil-L-triozin pentapeptid előállítására
1 183 579 2 A találmány tárgya új eljárás az Arg-Lys-Asp-Val-Tyr pentapeptid szintézisére. Ismeretes, hogy a csecsemőmirigy (timusz) számos olyan hormonhatású polipeptidet választ ki, amely hozzájárul a limfociták differenciálódásához, és így jelentős szerepet tölt be a szervezet immunrendszerének működésében. E hormonok egyikét, a T-limfociták szelektív differenciálódását szabályozó timopoietint 1975-ben izolálták és egyben szerkezetét is meghatározták [4077 949 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás]. A további vizsgálatokban kiderítették, hogy a 49 aminosavból álló hormon valószínű aktív centrumát a 32—36 szekvencia, az Arg-Lys-Asp-Val-Tyr pentapeptid alkotja [G. Goldstein, M. P. Scheid, E. A. Boyse, D. H. Schlesinger, J. Van Wamve: Science, 204, 1309 (1979)], amely megőrzi a teljes hormon biológiai hatásait [D. H. Schlesinger, G. Goldstein: Cell, 5, 361 (1975)]. Széles körű biológiai vizsgálatok szerint ez a pentapeptid ígéretes anyagnak tűnik a különböző eredetű immunszupresszív állapotok kezelésében [S. J. Hopkins: Drugs of Future, 5, 625 (1980)]. A szakirodalomban „TP—5”-nek nevezett pentapeptidet szilárd fázison [824 121 sz. belga és 4 190 166 sz. USA szabadalmi leírás] és oldatban is [T. Abiko, I. Ónodéra, H. Sekino: Chem. Pharm. Bull., 28, 2507 (1980)] szintetizálták. Mindkét módszernek számos hátránya van, amely megnehezíti a reakciók méretnövelését, a gazdaságos ipari előállítást. A szilárd fázisú peptidszintézisben a szilárd hordozóra kapcsolt pepiid acilezésére a védett aminosavszármazékokat a kapcsolási reagenseket legalább kétszeres fölöslegben kell alkalmazni a reakciók teljessé tétele érdekében [R. B. Merrifield: J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963); M. Monahan, J. Rivier: Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 1100 (1972); J. Rivier és munkatársai: J. Med. Chem., 16, 54'.' (1973)], emellett az egész eljárásnak nagy az oldó' r ukséglete. Emiatt, továbbá a szilárd fázisú pepi.* iia ázis ismert problémái (hibás és csonka szék ven; ák keletkezése) miatt ezt a módszert ezideig ipari szintézisre még nem alkalmazták. Mind a szilárd fázisú, mind az oldatban végzett TP—5 szintéziseknél olyan védőcsoport-kombinációt alkalmaztak, amely számos nemkívánatos mellékreakcióra ad lehetőséget. A szintézisek során az aminovégi savérzékeny védőcsoportot mindkét esetben trifluor-ecetsavval távolították el, így a lépésenkénti lánchosszabbítás során a peptideket ismételten savval kezelték. A szintézis végén a hordozóról való lehasítást és az összes többi védőcsoport eltávolítását cseppfolyós hidrogén-fluoriddal végezték. Az ismételt savas kezelések számos mellékreakciót idézhetnek elő; így az aminocsoport alkileződését [A. R. Mitchell, R. B. Merrifield: J. Org. Chem., 41, 2015 (1976)], a benzilészterek részleges hasadását (E. Schnabel, H. Klostermeyer, H. Berndt: Ann. Chem., 749, 90 (1971)], a peptid-hordozó kötés részleges hasadását [B. Gutte, R. B. Merrifield: J. Bioi. Chem., 246, 1922 (1971); B. Gutte: J. Bioi. Chem., 250, 889 (1975)], a tirozin alkileződését [P. Sórup, H. Braae, P. Villemoes, T. Christensen: Acta Chem. Scand., B33, 653 (1979); B. F. Lundt, N. L. Johansen, J. Markussen: Int. J. Peptide Protein Rés., 14, 344 (1979); B. W. Erickson, R. B. Merrifield: J. Am. Chem. Soc., 95, 3750 (1973); D. Yamashiro, C. H. Li: J. Org. Chem., 38, 591 (1973)], az aszparaginsav gyűrűzárását [ I. Schön, L. Kisfaludy: Int. J. Peptide Protein Rés., 14, 485 (1979) ; Peptides: Structure and Biological Function, Proc. 6th Amer. Peptide Symp. (E. Gross, J. Meienhofer szerk.) Pierce Chem. Co., Rockford, 1979, 277—280]. A yö-benzil-aszparaginsavat tartalmazó peptidek szintén nagyon hajlamosak a gyűrűzárásra [M. Bodanszky, J. Z. Kwei: Int. J. Peptide Protein Res., 12, 69 (1978)]. E mellékreakciók fellépése miatt mind a szilárd fázison, mind az oldatban szintetizált TP—5-öt [824121 sz. belga és 4 190166 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, T. Abiko, I. Ónodéra, H. Sekino: Chem. Pharm. Bull., 28, 2507 (1980) ] ioncserés oszlopkromatográfiával kellett megtisztítani. A szilárd fázison szintetizált termék 94%-os tisztaságú. Az ismert eljárások méretnövelését — a már említett nagy oldószerigény mellett — mind a hidrogénfluoridos védőcsoporteltávolítás alkalmazása, mind az ioncserés oszlopkromatográfiás tisztítás igen megnehezíti, illetve gazdaságtalanná teszi. Azt találtuk, hogy az ismert eljárások említett hátrányai kiküszöbölhetők és az Arg-Lys-Asp-Val-Tyr pentapeptidet jó hozammal, mellékreakciók nélkül, kromatográfiás továbbtisztítást nem igénylő tisztaságban állíthatjuk elő oldatban történő lépésenkénti lánchosszabbítás útján, ha az egyes kapcsolási lépésekben az L-valin, L-aszparaginsav, • illetve L-Iizin aminovégi védőcsoportjaként valamely katalitikus hidrogénezéssel eltávolitható védőcsoportot, mégpedig benzil-oxikarbonil-csoportot, az L-aszparaginsav /í-karboxil-csoportjának és az L-lizin cu-aminocsoportjának, valamint az utolsó kapcsolási lépésben az L-arginin aminovégi védőcsoportjaként pedig trifluorecetsavval eltávolítható védőcsoportot alkalmazunk és az aminovégi védőcsoportot az egyes kapcsolási lépések után — az utolsó lépés kivételével — katalitikus hidrogénezéssel, az utolsó kapcsolási lépés után pedig az összes jelenlevő védőcsoportot trifluorecetsavas kezeléssel távolítjuk el. Az L-aszparaginsav /?-karboxilcsoportjának és az L-iizin ru-aminocsoportjának átmeneti védelmére tehát„a találmány szerinti eljárásban olyan, trifluorecetsavval eltávolítható védőcsoportokat alkalmazunk, amelyek az egyes kapcsolási reakciók után a közbenső termék aminovégi védőcsoportjának eltávolítására alkalmazott katalitikus hidrogénezése során nem hasadnak le, az utolsó kapcsolási lépés után azonban az L-arginin aminovégi védőcsoportjának trifluor-ecetsavval történő eltávolítása során egyidejűleg szintén lehasadnak. Ezért az L-aszparaginsav /I-karboxilcsoportjának átmeneti védelmére terc-butiloxi-csoportot az L-Iizin cu-aminocsoportjának átmeneti védelmére pedig, ugyanúgy mint az L-arginin aminovégi védőcsoportjaként terc-butiloxikarbonil-csoportot alkalmazunk. A találmány szerinti eljárás utolsó lépésében, a védőcsoportok trifluorecetsavval történő lehasítása után az Arg-Lys-Asp-Val-Tyr pentapeptidet trifluoracetátsó alakjában kapjuk. Ebből ismert módon, például ioncsere útján, állíthatjuk elő a szabad pentapeptidet vagy annak valemely más sóját. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitele során tehát az első lépésben például benziloxi-karbonil-5 10 5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
