183542. lajstromszámú szabadalom • Eljárás VIII (AHF)-faktor -koncentrátum előállítására
1 183542 2 — az emberi vagy állati plazmát először krioprecipitációval kezeljük, — a krioprecipitátumot vizes pufferoldatban feloldjuk, pH-ját 6,25-re állítjuk be, és az oldatot PLURONIC-oldattal kezeljük, — a csapadék eltávolítása után kapott maradékot legalább még egyszer kezeljük PLURONIC-oldattal, és — végül a csapadékok eltávolítása után kapott tisztított, VIII(AHF)-faktorra nézve feldúsított frakció krialkoholos kicsapással kezeljük, ahol a frakcióhoz egy- vagy többértékű alkoholt, mint pl. metanolt, eta nőit, polietilén-glikolt vagy poliészter-glikolt (PLURONIC) adunk, az elegyet mélyfagyasztjuk, majd 0 és 4 °C közötti hőmérsékleten felengedtetjük, az AHF-tartalmú koncentrátumot feloldjuk, és mélyfa gyasztással és liofilezéssel eltartható formába hozzuk A találmány szerinti eljárást a következő példákká szemléltetjük. 1. példa 4601 frissen fagyasztott plazmát 0 és +4 °C között hőmérsékleten felengedtetünk. A kapott krioprecipi tátumot centrifogálással elválasztjuk, és 9,6 1 trinát rium-citrátban 37 °C-on feloldjuk. Az oldat pH-jái 6,2-re állítjuk be 3 súly/térf%-os polietilén-gliko 2000-t adunk hozzá. A kapott csapadékot centrifugá lássál elválasztjuk és eldobjuk. A VIII(AHF)-faktort tartalmazó maradék ionerősségét trinátrium-citrát hozzáadásával megnöveljük. A maradék nemkívánt fehérjetartalmat a polietilén-glikol 2000 koncentrációjának 8 súly/térf%-osra valé emelésével és centrifugálással távolítjuk el. A maradékhoz —2 °C-on, 6,1 pH-értéknél 8 súly/térf%-os etanolt adunk, és így a VlII-faktorkoncentrátum kicsapódik. A szuszpenziót megfagyasztjuk és +4 °C-on történt felengedtetés után a VlII-faktor-tartalmú krioalkohol-precipitátumot fiziológiás pufferben feloldjuk, sterilezzük adagoljuk és liofilezzük. 2. példa 9600 ml frissen fagyasztott plazmát 0 és +4 °C közötti hőmérsékleten felengedtetünk, lecentrifugálunk, és a krioprecipitátumot 240 ml trinátrium-citrátban oldjuk 37 °C-on. Az oldat pFI-ját 6,2-re állítjuk be és 3 súly/térf%-os polietilén-glikol 2000-t adunk hozzá. A kapott csapadékot elválasztjuk és eldobjuk. Trinátrium-citrát adagolásával növeljük az ionerősséget, 8 súly/térf%-os polietilén-glikol 2000 adagolásával a további nemkívánt fehérjét eltávolítjuk, elválasztjuk és eldobjuk. 6,0 pH-értéknél, — 2 és — 3 °C közötti hőmérsékleten 10 súly/térf%-os metanol adagolásával a VIII- faktor-koncentrátumot kicsapjuk, a szuszpenziót fagyasztjuk és felengedtetés után a krioalkohol-precipitátumot izotóniás pufferoldatban feloldjuk, sterilezzük, adagoljuk és liofilezzük. 3. példa A 2. példa szerinti eljárást ismételjük, azzal a különbséggel, hogy 10 súly/térf%-os metanol helyett 12%-os polietilén-glikolt használunk a Vili-faktor kicsapására. 4. példa A 2. példa szerinti eljárást ismételjük, azzal a különbséggel, hogy 10 súly/térf%-os metanol helyett 10 súly/térf%-os „PLURONIC”-oldatot használunk a Vili-faktor kicsapására. 5. példa 10,4 frissen fagyasztott plazmát 0 és +4 °C közötti hőmérsékleten felengedtetünk. A krioprecipitátumot 250 ml trinátrium-citrát-pufferral feloldjuk. Az oldat pH-ját 6,3-ra állítjuk be, és 2,5 súIy/térf%-os PLURONIC-oldatot adunk hozzá. A csapadékot eldobjuk. Az ionerősség növelése után a PLURONIC- koncentrációt 7,5 súly/térf%-ra emeljük, és a csapadékot ismét eldobjuk. A maradékot 6,0 pH-értéknél és —2 °C-on 8 súly/térf%-os etanollal kezeljük, így a VlII-faktorkoncentrátum kicsapódik. A szuszpenziót megfagyasztuk és +4 °C-on végzett felengedtetés után a krioalkohol-precipitátumot elválasztjuk. A találmány szerinti eljárással előállított koncentrátum lényegesen javított specifikus aktivitását, illetve a kiindulási plazmához képest több mint 200-szoros AHF-dúsulását mutatja az I. táblázat az ismert és kereskedelemben kapható AHF-koncentrátumokhoz képest. I. táblázat Specifikusság Egység/mg Tisztaság a plazmához viszonyítva Plazma 0,017 1 Krioprecipitátum 0,145 9-szeres Nagy tisztaságú AHF A találmány szerinti eljárással előállított koncent-1,667 98-szeres rátum > 3,500 206-szeres A II. táblázat az egyes készítmények fibrinogéntartalmának összehasonlítását mutatja. II. táblázat I-Cohn-frakció ^ 60% Fibrinogén I-O-Blomback-frakció ^ 80% Fibrinogén Nagytisztaságú AHF ^ 35% Fibrinogén A találmány szerinti eljárással előállított koncentrátum 10% Fibrinogén 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 65 3
