183542. lajstromszámú szabadalom • Eljárás VIII (AHF)-faktor -koncentrátum előállítására
1 183 542 9 A találmány tárgya eljárás VIII(AHF)-faktor-koncentrátum előállítására, amelynek specifikus aktivitása legalább 2,5 AHF-egység és kevesebb mint 0,25 mg fibrinogént tartalmaz 1 mg emberi vagy allati plazmára számítva. Az eljárást a plazma többfokozatú frakcionálásával, különösen fehérjekicsapós: terek — mint pl. polietilén-glikol — segítségével végzett krioprecipitálásával és tisztításával hajtjuk végre. Ismeretesek VIII(AHF)-faktorok, amelyeket emberi vagy állati plazmából állítanak elő, és amelyek a natív plazmánál nagyobb VlII-faktor-aktivitással rendelkeznek. A VlII-faktor-koncentrátumok előállítását a plazma etanol, éter, polietilén-glikol és/vagy glicerin segítségével végrehajtott frakcionálási eljárásával végzik. Ismert eljárás még a plazma arioprecipitálása Pool szerint (1965. „The New England Journal of Mediéirjt"' 273, 1443) vagy Johnson szn int (Congr. Int. Soc. Blood Transf., Sydney, Australia, Abstract of Paper, 1109 (1966)). A krioetanolos kicsapási eljárást ismerteti még J. Newman, A. J. Johnson, M. H. Karpatkin és S. Puszkin a Brit. J. Haematol 1971, 21, I. irodalmi helyen, míg a polietilén-glikolos krioprecipitációt J. Johnson, V. E. Macdonald és J. Brind a VOX SANG. 1979, 36, 72—76 helyen ismerteti. A Vili-faktor előállítására más módszerek is léteznek, mégpedig a plazma kezelése adszoipciós szerekkel, mint pl. Florigél, bentonit, ioncserélők és kromatografáló szerek. A plazma etanollal végzett kezelését először Cohn ismertette (J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946)). A plazma etanolos kezelésénél a c úgynevezett I-Cohn-faktort kapjuk, amely azonban viszonylag alacsony VlII-faktor-aktivitással rendelkezik. A Cohn-féle módszert Bombäck fejlesztette tovább (Aktív för Kérni, 12, 387 (1958)), szerinte a> I-Cohn-faktort etanol-glicin-citrát-pufferral kell extrahálni és így tovább tisztítani. így kapható az úgynevezett I-O-frakció. Simonetti és munkatársai szerint (Hémostase 1, 57 (1961)) ezt még tovább lehet tisztítani csorsavval, ez a javított koncentrátum azonban még m ndig csekély VlII-faktor-aktivitással rendelkezik. Ezeknek a koncentrátumoknak az a hátrányuk, hogy magas az idegen fehérje tartalmuk, azaz a Vili-faktor hatástalan fehérjéket is tartalmaz. így az I-Cohn-frakció több mint 60% fibrinogént, míg az I-O-Borrback-frakció több mint 80% fibrinogént tartalmaz. Az ismert krioprecipitátumot egy pu 'fer-oldatban feloldják és adott esetben fehérje kictapó szerrel, mint pl. polietilén-glikollal és glicinnel tnvább tisztítják. A krioprecipitációs módszerrel nem sikerült a VlII-faktor-aktivitást tovább növelni. A krioprecipitációval a VlII-faktor-aktivitást a kiindulási plazmához képest csak mintegy tízszeresre sikerült növelni, és a krioprecipitációval kombinált egyéb módszerek útján sem sikerült az aktivitást annyira növelni, mint az elvárható lenne. Első krioprecipitációval kombinált többfokozatú frakcionálási eljárásokat ismertetnek a 3 652 530, 3 631 018 és 3 682 881 számú amerikai :gyesült államokbeli szabadalmi leírások, valamint a 349 639 számú ausztriai szabadalmi leírás. Ezeket a termékeket nagytisztaságú AHF néven hozzák forgalomba. VlII-faktor-aktivitások azonban még mindig csupán 90—100-szorosa a natív plazmáénak, míg a Vili-faktorként hatástalan fehérjetartalmuk (fibrinogén) az összes protein 35%-át teszi ki. A találmány célja az ismertetett hátrányok és nehézségek kiküszöbölésével eljárás kidolgozása olyan VlII-faktor-koncentrátum előállítására, amelyben az inert, Vili-faktorként hatástalan fehérjék legteljesebb mértékben el vannak távolítva, és amelyben a fibrinogén tartalom a lehető legalacsonyabb értéken van tartva, míg a VlII-faktor-aktivitás a teljes fehérjetartalomra számítva magasabb, mint az eddig terápiás célokra használt preparátumok esetén. Közelebbről a találmány feladata VIII(AHF)-faktor-koncentrátum előállítására egy olyan eljárás kidolgozása melynek segítségével előállított termék legalább 2,5 AHF-egység specifikus aktivitással és 0,25 mg/mg fehérje fibrinogén-tartalommal ipari körülmények között gazdaságosan előállítható. Ezt a feladatot úgy oldottuk meg, hogy kidolgoztuk a bevezetésben ismertetett többfokozatú eljárást, ahol előnyösen az első fokozat krioprecipitáció, és a frakcionálási eljárással kapott VIII(AHF)-faktorra nézve feldúsított frakciót krialkoholos kicsapássa! kezeljük, és a kapott csapadékot eltartható készítménnyé alakítjuk. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítási módja szerint a VIII(AHF)-faktorra nézve feldúsított frakcióhoz 5,9 és 6,3 pH-érték között, 0 és —3 °C közötti hőmérsékleten egy-egy többértékű alkoholt, mint pl. metanolt, etanolt, polietilén-glikolt vagy poliészter-glikolt (PLURONIC) adunk, az elegyet mélyhűtjük, majd 0 és 4 °C közötti hőmérsékleten felengedtetjük, az AHF-koncentrátumot tartalmazó csapadékot feloldjuk és mélyfagyasztással és liofilezéssel eltartható készítménnyé alakítjuk. A találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási módja a következő lépések kombinációját tartalmazza: — az emberi vagy állati plazmát először krioprecipitációval kezeljük, — a krioprecipitátumot vizes pufferoldatban feloldjuk, pH-ját 6,15 és 6,25 közötti értékre állítjuk be, és az oldatot polietilén-glikollal tisztítjuk. — a csapadék eltávolítása után kapott maradékot legalább még egyszer kezeljük polietilén-glikollal, és — végül a csapadékok eltávolítása után kapott tisztított Vili-faktorra nézve feldúsított frakciót krioalkoholos kezelésnek vetjük alá, ahol ehhez a frakcióhoz eg)'- vagy többértékű alkoholt, mint pl. metanolt, etanolt, polietilén-glikolt vagy poliészter-glikolt (PLURONIC) adunk, az elegyet mélyfagyasztjuk, majd 0 és 4 °C közötti hőmérsékleten felengedtetjük, az AHF-koncentrátum tartalmú csapadékot feloldjuk és mélyfagyasztással és liofilezéssel eltartható formába hozzuk. Az első polietilén-glikolos kicsapatást előnyösen 3 súly/térf %-os polietilén-glikollal, a második és a további kicsapást 8 súly/térf. %-os polietilén-glikollal végezzük. A VlII-faktor-koncentrátum kicsapására előnyösen mintegy 10 súly/térf. %-os PLURONIC-oldatot használunk. Polietilén-glikol mint fehérjekicsapó-szer helyett PLURONIC is használható, ebben az esetben az eljárás a következő lépésekből áll: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 fiO 65 2
