183433. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyűszűvirág (Digitális Lanata EHRH.) szaporítóanyag előállítására szövettenyészetben
1 183 433 2 szoktatásához szigorúan megszabott lépésszámot alkalmazunk, szigorúan megszabott sorrend és körülmények (paraméterek) betartása mellett. A találmány eljárás gyűszűvirág (Digitalis lanata Ehrh.) szaporítóanyag (palánta) szövettenyészetben vegetatív mikroszaporítással történő előállítására a növény magvának vagy a szántóföldi növény hajtáscsúcsának felszíni sterilezése után, azzal jellemezve, hogy- a steril magból vagy a steril szántóföldi növény hajtáscsúcsából ismert táptalajon néhány, előnyösen 2-3 lombleveles steril növényt állítunk elő;- a néhány, előnyösen 2-3 lombleveles steril növényt adott esetben gyökérmentesítjük, majd auxin(oka)t, citokinin(eke)t és kívánt esetben gibberellinsavat tartalmazó szaporító táptalajra oltjuk át (passzáljuk) és mintegy 20-40 oldalhajtást tartalmazó állapotig szaporítjuk, majd a növényt, előnyösen 2-3 lombleveles levélrózsákra osztjuk szét és kívánt esetben a szaporítást a szükséges növényszám eléréséig ismételjük;- az előnyösen 2-3 lombleveles steril levélrózsákat auxint vagy auxint és citokinint tartalmazó gyökeresítő táptalajra ültetjük át és 4-8 mm hosszúságú gyökérhossz eléréséig gyökeresedést indukálunk;- a 4-8 mm hosszúságú gyökérrel rendelkező növényeket auxin(ok)tól és citokinin(ek)től mentes táptalajon 4-6 cm gyökérhosszig gyökeresítjük és- kívánt esetben az így kapott szaporítóanyagot (palántát) szabadföldi körülményekhez szoktatjuk. Az eljárás első lépésében ismert módon fertőtlenített magból, vagy fertőtlenített szántóföldi növény hajtáscsúcsából néhány, előnyösen 2—3 lombleveles steril növényt állítunk elő valamely irodalomból ismert táptalajon. [Linsmaier és Skoog, Phisiol. Plantarum, 18, 100— 127, (1965); Nitsch és Nitsch, Science, 163, 85-87, (1969)]. A találmány szerint a második lépésben a steril növények előnyösen 2-3 lombleveles hajtásait szaporító táptalajra helyezzük. A szaporító táptalaj feladata, hogy a tenyésztés során minél nagyobb számú oldalhajtást indulkáljon és ezzel tömeges levélrózsát hozzon létre. A szaporító táptalaj lényegileg a fenti idézett két táptalaj valamelyike, kiegészítve azonban auxin(ok). citokinin(ek) és kívánt esetben gibberellinsav megfelelő kombinációjával. Alkalmazható auxin például az indolecetsav 0,1-1,0 ppm. vagy a 2,4-diklórfenoxi-ecetsav 0,01- 0,05 ppm koncentrációban. Az auxinnal kombinált citokinin például a benzil-aminopurin 0,1-1,0 ppm mennyiségben. A két komponens aránya 1:1—1:10 között változhat. Ha az auxin, citokinin aránya 1:1, úgy a szövettenyészetben szaporított növények fejlődése abban az esetben kedvezőbb, ha a szaporító táptalajhoz harmadik adalékként 0.1-0,5 ppm mennyiségű gibberellinsavat is adunk. A tenyészeteket 24 C ± 2-on, előnyösen 16 órás nappal és 8 órás éjszakai fotoperiodicitás mellett, 9-14000 lux megvilágítással, 50—80% relatív páratartalom mellett inkubáljuk. A tenyésztési idő 4-6 hét. A legalább 30 oldalhajtást képző, elágazó töveket - steril körülmények között - 2—3 lombleveles hajtásokra osztjuk szét. és az önálló fejlődésre képes hajtásokkal a fenti paraméterek mellett újabb szaporítófázist indítunk. A szétosztás és a szaporítás tetszőleges számban ismételhető, mindaddig, amíg a célnak megfelelő számú szaporítóanyagot (palántát) elő nem állítunk. Kellő egyedszáin elérése után, a kiültetés lehetővé tételére a növények gyökercsedését kell indukálni (harmadik lépés). A felszaporított, 2—3 lombleveles növényeket gyökeresítő táptalajra ültetjük át. A gyökeresítő táptalaj a fent idézett Nitsch és Nitsch vagy a Linsmaier-Skoog táptalaj, illetve ezek előnyösen módosított változata, amely(ek) az eredeti táptalaj makroelemeinek felét tartalmazza(k). Mindkét gyökeresítő táptalaj kötelezően auxint vagy auxint és az auxinra számított 1/10 mennyiségű citokinint tartalmaz. Amennyiben az auxin indolvajsav, úgy mennyisége a táptalajban 0,1—0,5 ppm között változhat, auxin-citokinin kombináció esetében például az a-naftilecetsav mennyisége 1 ppm, a kinetin 0,1 ppm. A gyökérképződés gyorsabb és a gyökerek életképessége jobb, ha alacsony hormontartományt alkalmazva a táptalajban levő makroelemek mennyiségét a megelőző fázisban használt táptalajéhoz képest a felére csökkentjük. Rendkívül lényeges, hogy a harmadik lépést csak a gyökeresedés megindulásáig folytassuk. A 4-8 mm hosszúságú gyökérrel rendelkező növényeket — a negyedik lépésben — hormonmentes táptalajra ültetjük át. A hormonmentes gyökeresítő táptalaj makroelem mennyisége azonos az előző lépésben alkalmazottal. Ha a gyökérindukált tenyészeteket hormonmentes táptalajon neveljük tovább, akkor nagy mennyiségű, erős gyökér képződik és a vegetatív részek fejlődése is megfelelő. Az inkubálás körülményei a harmadik és negyedik lépésben azonos az előzőekkel, együttes ideje 4—6 hét, az inkubálás végén a kiültetéshez megfelelő fejlettségű, gyökeres palántákat kapunk. A találmány szerinti eljárás ötödik, utolsó lépése a palánták hozzászoktatása a nem steril, szabadföldi életkörülményekhez. A palántákat homok: perlit, vagy tőzeg: perlit keverékével töltött cserepekbe ültetjük. A keveréket 70% víztartalomig nedvesítjük, homok .perlit keverék esetében a nedvesítést makro- és mikroelemeket tartalmazó oldattal (módosított KNOPP-oldat) végezzük. Az inkubálás félsteril körülmények között fitoboxban vagy a cél szerinti hő- és páratartalom értékekre szabályozott üvegházban történik. Az alkalmazkodási idő 4-5 hét. A szövettenyésztéses vegetatív mikroszaporítás előnye, hogy- a fajtaazonosság megőrizhető,- egyetlen egyed felszaporítása évszaktól és időjárástól függetlenül folyamatosan elvégezhető,- egyetlen egyedből tetszés szerinti számú homogén növény állítható elő. A vegetatív mikroszaporítás eszerint felhasználható a gyűszűvirág faj ta-fenntartására, a növény nemesítésére, valamint a termesztést szolgáló homogén magállomány előállítására. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk. 1. példa 10 db nemesített gyűszűvirág vetőmagot 10 percig Na-hipoklorit 10%-os vizes oldatában felszíni sterilezésnek vetjük alá, majd háromszor steril vízzel öblítjük. A sterilizált magvakat Nitsch-féle Nitsch és Nitsch, Science, 163, 85-87 (1969) táptalajon csíráztatjuk, majd a csíranövényeket 2-3 lombleveles állapotig (3 hét) növesztjük. A táptalaj összetétele a következő: KNOj 950,0 mg/I NH4NO3 720,0 mg/1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
