183388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli ST enterotoxin származékok előállítására
1 183 388 2 Ezt a tápközeget aerob inkubáljuk 36 °C-on 10-15 óráig keverve, azaz addig keverve, amíg pH eléri a 8,2-8,4 értéket és az oxigénfogyasztás megközelíti a 0-t. Az előállítási lépés végén a fermentlevet 30 percig 60 °C-ra melegítjük és 6000 g-nál centrifugáljuk, majd a szupematánst Seitz EKS1 szűrőn keresztül leszűrjük. Az ST enterotoxint ezután három lépése s folyamatban koncentráljuk és tisztítjuk a következő módon: Az első lépésben a szűrt fermentlé 40 literes alikvotját 5 liter térfogatra koncentráljuk, ezernél kisebb molekulasúlyú termékeket átengedő és nagyobb molekulasúlyú termékeket át nem eresztő Pellicon PTAC membránon keresztül történő szűréssel (Pellicon PTAC egy cellulóz vegyes észtereket tartalmazó ultra membrán védjegye, melyet a Millipore Corporation, Bedford Massachusettes, Amerikai Egyesült Államok-beli cég állít elő), majd ugyanezen a Pellicon PTAC membránon keresztül dialízissel, amíg a vezetőképesség 500 mikrosiemensre nem csökken. A kapott frakciót ezután továbbkoncentráljuk, míg a térfogat 1 liter lesz és liofilizáljuk. A fagyasztva szárított terméket ST-MP-nek nevezzük. A második lépésben az ST-MP termék 3 grammos alikvotját 150 ml vízben oldjuk és az oldatot 0—4 °C-ra hűtjük. 1,5 liter hideg acetont csepegtetünk hozzá keverés közben és az elegyet 30 percig keverjük, miután a teljes acetont hozzáadtuk. Az elegyet 300 grammnál centrifugáljuk és a szupematánst csökkentett nyomáson 30 ml térfogatra koncentráljuk, majd ehhez 180 ml 2:1 v/v arányú metanol és kloroform elegyet adunk. Intenzív rázás után 42 ml vizet adunk hozzá, és a felső réteget elválasztjuk, csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és liofilizáljuk- A liofilizált terméket ST-ACF-D- nek nevezzük. A harmadik lépésben az ST-ACF-D termék 200 mg-os alikvotját 2 ml vízben oldjuk és 2,5X30 cm-es, 50 g Servachrom-8-at tartalmazó, vízzel egyensúlyozott hűtött oszlop tetejére visszük. (A Servachrom-8 a Serva GmbH és Co. Heidelberg, NSZK-beli cég kromatográfiás poliakrilmetilészterének védjegye). Az eluálást vízzel végezzük, az első frakció eluálása után az eluálást metanol és víz 6:4 v/v arányú elegyével folytatjuk, hogy az St-tartalmú frakciót eluáljuk. Az ST-t az oldószer elpárologtatásával izoláljuk és a kapott maradékot ST-PAE-nek nevezzük. Az ST-PAE 1000-4000 tisztasági tényezőt mutat a kiindulási aktivitáshoz képest és az ST-PAE-termék fajlagos aktivitása sarasonként 5,5 és 15 nanogram között változik. A frakciók biológiai aktivitását újszülött egér-teszttel mutatjuk ki. A. G. Dean (J. Infect. Dis. 125, 407-411, 1972) módszere szerint. A módszer szerint 48-72 órás egereket intragasztikusan beoltjuk 0,025 ml toxin oldattal és 2 óra múlva mérjük a bélben felhalmozódott folyadék mennyiségét. A bélsúly/testsúly arány a toxin biológiai aktivitásának mértéke. A 0,09 értéknél nagyobb, ill. azzal egyenlő értékeket pozitívnak tekintjük. Az ST frakció fajlagos aktivitását az ST-nek a liofilizált termék nanogrammjaiban megadott olyan mennyiségében fejezzük ki, amely segítségével az egér-tesztnél a bélsúly/testsúly érték 0,100-nak adódik. 2. példa 10mg ST-PAE-t 0,25 ml 5,1 pH értékű acetát pufferben oldunk és ebből ugyanebben a pufferben oldott 0,25 ml 36 súly/térfogat%-os nátriumszulfát fv val csapjuk ki. Vizes glutáraldehidet adunk , (a 25 v/v%-os oldat 20 mikroliterét) és a reakciót szOv hőmérsékleten 2 óráig folytatjuk. A reakcióidő lejárta után a reagens feleslegét centrifugálással választjuk el, vízzel mossuk és a csapadékot liofilizáljuk. A liofilizált termék a módosítatlan kiindulási anyagként használt ST-hez képest megnövekedett molekulasúlyú immonogén térhálós ST-t tartalmaz, amint ezt a Sephadex G-100-on történő gélkromatográfiával meghatároztuk. (A Sephadex kromatografálás során használt töltet dextrán készítmény, melyet a svéd, uppsala-i Pharmacia cég hoz forgalomba). A molekulasúly megnövekedésének kimutatására a liofilizált terméket 1 ml víz hozzáadásával és az elegy két óráig tartó szobahőmérsékleten történő keverésével részben feloldjuk. A feloldott frakció az oldhatatlan frakció 30-50 %-át képezi és 10 000-nél mutatja a fő csúcsot, míg ugyanolyan feltételek mellett a kiindulási ST-PAE a főcsúcsot 4000-nél mutatja (a csúcs a Sephadex G-100- on a Vt mögött, a Vt az oszlop ágytérfogata). 3. példa 20 mg ST-PAE-t 1 ml vízben feloldunk és 200 mg l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid-hidrokloridot adunk hozzá. Az elegyet 25 °C-on 12 óráig állni hagyjuk, ezalatt a térhálósodási reakció lejátszódik. Az oldódó reakcióterméket PM-10 Amicon membránon dializáljuk (az Amicon az Amicon Társaság, Lexington, Massachusettes, Amerikai Egyesült Államok-beli cég által forgalmazott ultramembrán védjegy), ily módon a nem reagált ST-t eltávolítjuk és a visszamaradt 13 mg frakciót liofilizáljuk. Az ily módon térhálósított ST molekulasúlya kb. 10 000 (a kündulási anyag 2000 molekulasúlyával szemben), a molekulasúlyt a 2. példában jelzett módon gélkromatográfiával állapítjuk meg Sephadex G-100-on. A térhálós ST abszorpciós spektruma is eltér a kündulási anyagként használt ST-PAE frakció abszorpciós spektrumától. ’ 4. példa 5 mg ST-PAE-t feloldunk 0,5 ml 0,1 mólos, 8,0 pH-jú borátban pufferban (Na2 B407/Na0H) és 100 mikroliter 0,02 mólos etanolos difluordinitrobenzol oldatot adunk hozzá. A térhálósító reakciót keverés közben 4 óra hoszszat szobahőmérsékleten folytatjuk. A reakcióidő elteltével a nem reagált ST-t Spectrapor dialízis csövön keresztül dializáljuk, amely a 14 000-nél kisebb molekulasúlyú termékeket engedi át. (Spectrapor a Spectrum Medical Industrie New York, Amerikai Egyesült Államok-beli cég által forgalmazott dializálócső védjegye). A 2. példa szerint végzett gélkromatográfia szerint Sephadex G-100-on az oldódó térhálós ST molekulasúlyát 50 000-re becsüljük, a kündulási anyagként használt ST-PAE 2000-es molekulasúlyával szemben. A kapott térhálós ST-abszorpciós spektruma további csúcsot mutat 350 nanométernél a kiindulási anyagként használt ST-PAE abszorpciós spektrumához képest. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
