183388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli ST enterotoxin származékok előállítására
1 183 388 I. táblázat 2 5. példa 100 mg liofilizált ST enterotoxin származékot, melyet a 2. példa vége szerint kapunk, 0,5 liter fiziológiai sóoldatban és 0,5 liter Freund-féle komplett adjuvánsban oldunk és a készítményt egyenként a hatásos állatgyógyászati alkalmazásra használatos mennyiségű térhálós ST enterotoxin dózisnak megfelelően üvegampullákba osztjuk szét. Az ampullákat légmentesen lezárjuk és 4 °C-on tartjuk. 6. példa 100 mg liofilizált ST enterotoxin származékot, melyet a 2. példa vége szerint kapunk, 1 liter fiziológiás sóoldatban és 10 g Alhydrogélben szuszpendálunk (az Alhydrogél a Superfos Export Company, Copenhagen, Dánia cég terméke), és a térhálós, humán gyógyászatra alkalmas ST enterotoxint tartalmazó készítményt hatásos dózisokban üvegampullákba helyezzük. Az ampullákat hermetikusan lezárjuk és 4 °C-on tartjuk. 7. példa Az 5. példa szerint előállított készítményt három (A, B és C) nyúlnak szubkután adagoljuk 0,1 mg/állat dózisegységenként és ugyanezt a szubkután adagolást 21 nap múlva megismételjük. Vérmintákat, azaz antiszérumot veszünk az első adagolás után 28 nappal. Az immunizált nyulak vérszérumát megvizsgáljuk, hogy mennyire semlegesítették in vitro 2 óra alatt 37 °C-on az első egér-teszttel mért, rögzített mennyiségű ST-t. (A. G. Dean, lásd fent) Kontrollként foszfátpuffert alkalmaztunk fiziológiai sóoldattal vagy normális szérumot az antiszérum helyett. A szérum semlegesítési teszt eredményeit az alábbi I. táblázat foglalja össze, ahol a PBS jelentése 8 g nátriumkloridot, 0,2 g káliumkloridot, 1,15 g dinátriumhidrogénfoszfátot, 0,2 g káliumdihidrogénfoszfátot tartalmazó 800 ml vízben oldott pufferoldatot jelent összekeverve 100 mg magnéziumklorid'6H20 100 ml desztillált vízzel készített oldatával, majd 0,1 g kalciumklorid 100 ml desztülált vízzel készített oldatával,- a bélsúly/testsúly értékek 0,09-nél kisebb értékei az ST semlegesítést mutatják;- minden bélsúly/testsúly érték három mérés átlageredménye és minden érték 4 egérből álló csoport bélsúly/testsúly arányát mutatja;- az ST térfogatok ml-enként 1,4 meg ST-ACF-D toxint tartalmazó ST oldatra vonatkoznak. Séma Antiszérum hígítás bélsúly/ testsúly 0,5 ml ST + 0,5 ml PBS — 0,102 \ nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml 1/16 0,064 antiszérum 1/32 0,087 1/128 0,097 B nyúl 0,3 ml ST + 0,5 ml 1/4 0,059 antiszérum 1/8 0,100 C nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml 1/8 0,059 antiszérum 1/16 0,098 Az eredmények a térhálós ST immunogenicitását mutatják. 8. példa Az 5. példa szerint előállított, de a 3. példa szerint térhálósított toxint tartalmazó készítmény (az oldható frakció molekulasúlya 10 000 fölött) szubkután 3 nyúlnak, a K, L és M nyúlnak adagoltuk 0,1 mg/állat dózissal és ugyanezt a szubkután adagolást megismételtük 21 nappal később. Vérmintákat, azaz antiszérum mintákat vettünk az első adagolás után a 28. napon és a szérumsemlegesítési kísérleteket a 7. példában leírt módon végeztük, de PBS helyett normál szérumot használtunk. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja, amely a három állat közül egy állatnál mutatja a térhálós ST immunogenicitását. II. táblázat Séma Antiszérum hígítás bélsúly/ testsúly Kontroll 0,5 ml ST + 0,5 ml szérum 0,129 L nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum 1/1 0,060 K nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum 1/1 0,100 M nyúl 0,5 ml ST + 0,5 ml antiszérum 1/1 0,111 9. példa Az 5. példában leírt módon előállított, de a 4. példa szerint kapott térhálós toxint tartalmazó (14 000-en felüli molekulasúly oldékony frakció) készítményt szubkután 3 nyúlnak, a H, I és J nyúlnak adagoljuk állatonként 0,5 ml dózisegységben és ugyanezt a szubkután adagolást 21 nap múlva megismételjük. Az adagolás után 28 nappal vérmintát, ill. antiszérum mintát veszünk és a szérumneutralizációs tesztet a 7. példa szerint megismételjük. Az eredményeket a III. táblázat mutatja, amely a térhálós ST immungenicitását is jelzi. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
