183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására
1 183 283 2 old., Wiley, New York (1930); G. H. Jonker, H. R. Kruyt (Ed.), „Colloid Science”, Vol /, Elsevier, Amsterdam (1952); F. B. Gribnau, Disszertáció, Utrecht (1935)]. 9.2.2 LumfixR Red BF(BASF) a) LurafixR Red BF acetonnal készült oldatát (1 ml, 0,5 g/1) erőteljes keverés közben hozzáadtuk desztillált vízhez (24 ml). Ezt követően az acetont vákuumban és szobahőmérsékleten óvatosan lehajtottuk. Egy kezdetben stabilis szolon keresztül végül egy csapadékot kaptunk. A szuszpenziót 30 percig centrifugáltuk (1000 g = 9800 N/kg), a pelletet 25 ml desztillált vízben ismét szuszpendáltuk, majd ultrahangos kezelésnek vetettük alá (Branson Sonifier B—12, 2 perc, 70 watt). b) LurafixR Red BF acetonnal készült oldatát (1 ml, 5 g/1) erőteljes keverés közben hozzáadtuk desztillált vízhez (249 ml, 50 °C). Egy perc elteltével az elegyet 50°C-ról lehűtöttük szobahőmérsékletre. Egynapos, szobahőmérsékleten való állás után a kezdetben stabilis szol részlegesen flokkulálni kezdett. Scanning elektronmikroszkóppal felvételeket készítettünk mindkét frissen előállított szolról. A felvételek a mellékletben az 1. és 2. képen láthatók (15 000-szeres nagyítás). 9.3 Zsírban oldódó színezékek (oldószerben oldódó színezékek) A zsírban oldódó színezékek a hidrofób szerves színezékek olyan csoportja, amelyek vízben oldhatatlanok, viszont szerves oldószerekben, illetve azok. különböző keverékeiben oldhatók. A 2.2 pontban ismertetett kondenzációs módszert alkalmazva ezekből a színezékekből vizes közegben szolok állíthatók elő. 9.4 Csávaszínezékek Ezek a vízoidható antrakinoid vagy indigoid színezékek lúgos közegben végrehajtott redukcióval átalakíthatok a megfelelő leuko-vegyületekké. Ezekből ezután szabályozott oxidációval színezék szolok állíthatók elő. A leuko-vegyületek (oldhatóvá tett csávaszínezékek) - amelyeket szulfát-észter formájában stabilizálunk — szintén felhasználhatók erre a célra. 9.5 Szerves pigmentek Ezek, a definíciószerűen vízben és szerves közegben oldhatatlan színezékek egy diszperziós módszeT segítségével [lásd P. Nylen és E. Sunderland, „Modern Surface Coatings”, Interscience Publishers, London (1965)] átalakíthatok kolloid „oldatokká”. 10. példa Változatok az 1. példa szerinti (1.2) színezék/immunoglobulin konjugátok előállítására. 10.1 Immunoglobulin rögzítése kolloid színezék szemcséken 10.1.1 Lurafix* Blue FFR (BASF) LurafixR Blue FFR acetonnal készült oldatát (5 ml, 1 g/1) erőteljes keverés közben hozzáadtuk desztillált vízhez (245 ml). 30 perc centrifugálás után (1000 g = 9800 N/kg) a szupernatáns folyadékot eltávolítottuk, és a pelletet 50 ml desztillált vízzel mostuk. A pelletet az 50 ml térfogathoz szükséges mennyiségű desztillált vízben újra szuszpendáltuk, majd a szuszpenziót ultrahangos kezelésnek vetettük alá (Branson Sonifier B—12, 2 perc, 70 watt). A kapott szolt felhígítva: A^ = 1,0. Nyúl anti-FICG immunoglobulin oldatot (0,2 ml, 1 mg'ml egy 6 mmól NaCl/liter koncentrációjú oldatban, pH=7,0) hozzáadtunk az imént elkészített szolhoz, és a keveréket 16 órán át tároltuk szobahőmérsékleten. Ezt követően egy CarbowaxR—20M oldatot (0,2 ml, 10 g/1 egy 5 mmól NaCl/liter koncentrációjú oldatban, pH=7,0) adtunk hozzá, 30 percig tartottuk szobahőmérsékleten, majd 30 percig centrifugáltuk (4000 g = 39 200 N/kg). A pelletet CarbowaxR—20M oldattal kétszer mostuk, majd 5 ml végső térfogathoz szükséges mennyiségű CarbowaxR—20M oldatban újra szuszpendáltuk. Megismételtük a fent ismertetett eljárást, de normál nyúl immunoglobulint használva. A konjugátok immunoaktivitását a következőképp állapítottuk meg: A konjugátok 2 ml-es mintáit az imént említett CarbowaxR — 20M oldattal felhígítottuk. Ehhez hozzáadtunk 0,1 ml, torma peroxidázzal (HRP) nyomjelzett HCG oldatot, és a reakcióelegyet két órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ezután az elegyet 30 percig centrifugáltuk (4000 g = 39 200 N/kg), majd a pelleteket CarbowaxR—20M oldattal kétszer mostuk, és kromogén/szubsztrátum (o-fenilén-diamin/karbamid-peroxid) oldatban újra szuszpendáltuk. Szobahőmérsékleten egy óra elteltével az enzimreakciót 4 mól/1 kénsavval megállítottuk, majd 30 perc centrifugálás után (4000 g = = 39 200 N/kg) mértük a szupernatáns folyadékok A49: értékét. Színezék/anti—HCG Igkonjugát: A492 = 0,556. Színezék/normál Igkonjugát: A4g2 = 0,275. 10.1.2 PalanilR Red BF (BASF) Fehérjék rögzítése szilárd hordozóanyagokon adszorpcióval és közvetlen vagy közvetett kovalens kötés kialakításával valósítható meg. Az utóbbi lehetőség a színezékben lévő megfelelő funkciós csoportok jelenlététől függ, Például egy diazokötés kialakításakor használhatunk aromás aminocsoportokat, míg a karboxilcsoportok egy karbodiimid segítségével aktiválhatok. Alifás primer aminocsoportok és hidroxilcsoportok cianogénbromid segítségével aktiválhatok. Felhasználhatók bifunkoíonális vegyületek is; így lehetőség van az aminokomponensek összecsatolására glutáraldehid használatával. Használhatunk továbbá reaktív diszperziós színezékeket is. Ezek olyan színezékek, amelyekben a kromofór egy, már önmagában reaktív csoporthoz kapcsolódik (például halogén-triazinok és halogén-pirimidinek). A következő példákat PalanilR Red BF (BASF) diszperziós színezékkel végeztük el az alábbi módon elkülönített frakciót használva: Az említett színezék vízzel alkotott diszperzióját (62,5 g/1) 30 percig centrifugáltuk (750 g = 7350 N/kg). A pelletet ötször desztillált vízzel, majd kétszer poli(vinil-alkohol) (PVA) vízzel készített oldatával (1 g PVA/1; PVA: MowiolR 28—29, Hoechst) mostuk. Végül a pelletet a 2 literes végtérfogat eléréséhez szükséges mennyiségű PVA oldatban (0,1 g PVA/1 5 mmól NaCl/1 oldatban, pH = 7,0) újra szuszpendáltuk. A kapott színezék szol 25 ml-es mintáit - adott esetben az alábbiakban részletesebben ismertetett kezelés után — összekevertük bárány anti—HCG immunoglobulin oldatával (0,65 ml, 40 mg/ml egy 5 mmól NaCl/1 oldatban, pH = 7,0). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
