183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására
1 183 283 2 E fehérének a kolloid színezék szemcséihez történő adszorbeáltatását és/vagy kötését 16 órán keresztül folytattuk az alább meghatározott feltételek mellett: 10.1.2.1 Adszorpció a) Adszorpció pH = 4,0 és 0 mól NaCl/1 mellett; b) Adszorpció pH = 4,0 és 0,1 mól NaCl/1 mellett; c) Adszorpció pH = 7,0 és 0 mól NaCl/1 mellett; d) Adszorpció pH = 7,0 és 0,1 mól NaCl/1 mellett; e) Adszorpció pH = 6,0 és 0 mól NaCl/1 mellett (a szolt és a fehérjét 4-es pH-n kevertük össze); és 0 Adszorpció pH = 6,0'és 0,1 mól NaCl/1 mellett (a szolt és a fehérjét 4-es pH-n kevertük össze). 10.1.2.2 Diazo-kapcsolás A színezéket NaNC>2/HCl használatával 4 °C-on diazotáltuk, majd a reakcióelegy pH-ját szilárd Na2C03- tal 8,6-re állítottuk be. Végül hozzáadtuk a fehérjét; és a diazokapcsolást 4 °C-on végrehajtottuk. a) NaN02: 0,1 mól/1; HC1: 0,1 mól/1; b) NaN02: 0,05 mól/1; HC1: 0,05 mól/1; c) NaN02: 0,01 mól/1; HC1: 0,01 mól/1. 10.1.2.3 Térhálósítás g'lutáraldehid segítségével A színezék szol glutáraldehid-koncentrációját 1 és 10mmól/l-re, majd a pH-t 7,4-re, illetve 10,0-ra állítottuk be. Szobahőmérsékleten egy óra elteltével a pH 10,0-ról 9,0-ra csökkent. Végül hozzáadtuk a fehérjét. A reakciót szobahőrmésékleten hagytuk végbemenni. a) Glutáraldehid: 1 mmól/1, pH = 7,4. b) Glutáraldehid: 10 mmól/1, pH = 7,4. c) Glutáraldehid: 1 mmól/1, pH = 10,0. 10.1.2.4 Aktiválás CNBr-dal A színezék szolt centrifugáltuk, majd a pelletet 7,0-es pH-jú, 5 mmól NaCl/1 koncentrációjú oldattal kétszer mostuk. Ezt követően ugyanabban az oldatban vagy PVA oldatában (10g/l egy 5 mmól NaCl/1 oldatban, pH = 7,0) újra szuszpendáltuk. A különböző szolok CNBr koncentrációját 0,045 és 0,005 mól/I-re, majd a pH-értékeket 4 mól/l-es NaOH oldattal 11,0-ra állítottuk be. A reakcióelegyeket 12,5 perc szobahőmérsékleten való állás után centrifugáltuk, és a pelleteket egy 4°C-os, 8,5 pH-jú, 0,1 mól/1 koncentrációjú NaHC03 oldattal kétszer mostuk. Ezt követően a pelleteket 0,025 mól/1 NaHC03 (pH = 8,5) oldattal a kezdeti térfogatra újra szuszpendáltuk. A fehérje kapcsolását 4°C-on hajtottuk végre. a) PVA koncentráció: 0 g/1, CNBr koncentráció: 0,045 mól/1; b) PVA koncentráció: 10 g/1, CNBr koncentráció: 0,045 mól/1; c) PVA koncentráció: 10 g/1, CNBr koncentráció: 0,005 mól/1. 16 óra elteltével a különböző reakcióelegyeket 30 percig centrifugáltuk (1000 g = 9800 N/kg). A szupernatáns folyadékokat eltávolítottuk, a pelleteket 7,0-es pH-jú 5 mmól NaCl/1 oldattal kétszer mostuk, majd a pelleteket ugyanebben az oldatban újra szuszpendáltuk Meghatároztuk a különböző konjugátok immuno-aktivitását. Mindegyik konjugát 5 ml-es mintáját tormaperoxidázzal (HRP) nyomjelzett HCG-vel inkubáltuk (16 óra, 4 °C, sötétben). Ezt követően a reakcióelegyeket 30 percig centrifugáltuk (1000 g = 9800 N/kg). A pelleteket 2 X 3 ml 5 mmólNaCl/1 oldattal (pH = 7,0) kétszer mostuk, majd egy kromogén/szubsztrátum oldatban (o-fenilén-diamin/karbamid-peroxid) újra szuszpendáltuk. Egy óra elteltével (szobahőmérséklet, sötétben) az enzimreakciót 4 mól/1 kénsavval megállítottuk, az elegyet 30 percig centrifugáltuk (1000 g = 9800 N/kg), majd mértük a szupernatáns folyadékok A492 értékét. A specifitás vizsgálata céljából a fenti eljárást elvégeztük csak HRP-vel is. Konjugár (HCG-HRP)*) A4 9 2*. (HRP) ) A4 9 2 **■> (HCG-HRP) ) 10.1.2.1-1. 0,195 0,094 b. 0,420 0,098 0,750 c. 1,738 0,109 1,970 i. 0,942 0,109 1,280 e. 0,230 0,109 t. 1,129 0,103 1,496 10.1.2.2-a. 0,738 0,120 1,260 b. 0,568 0,113 1,316 c. 0,777 0,086 1,505 10.1.2.3-a. 1,097 0,062 1,920 b. 0,489 0,07 3 c. 0,443 0,065 j. 0,436 0,118 10.1.2.4-a. 1,900 0,088 2,153 b. 1,300 0,137 2,020 c. 1,022 0,118 1,671 *A konjugátokat három különböző napon vizsgáltuk: 1. nap: 10.1.2.1-a/f. 2. nap: 10.1.2.2-ajc és 10.1.2.3-a/c. 3. nap: 10.1.2.4-a/c. **Ezeket a konjugátokat egyazon napon vizsgáltuk. 10.2 A színezék szol/immunoglobulin konjugátok másodbgos bevonásának hatása az immuno-aktivitásra A kísérletekhez PalanilR Red BF (BASF) színezéket, valamint az 1.1 pontban már ismertetett eljárás szerint előállított típusú szolt használtunk. A szol pH-értékét 0,1 mól/1 NaOH-dal vagy HCl-val 7,0-ra, extinkcióját (533 nm-en) pedig 5,0-ra állítottuk be. E szol 37 ml-es mintáit összekevertük egy nyúl anti- HCG mmunoglobulin oldattal (0,74 ml, 1 g/1 egy 5 mmól NaCl/1 oldatban, pH=7,0). Az lg koncentráció a reakcióelegyben 20 mg/1 volt. Egy órás, szobahőmérsékleten való inkubálás után a következő anyagokat adtuk a szolokhoz: a) Semmi. b) CarbowaxR— 20M a 0,2 g/l-es koncentráció eléréséig. c) BSA a 0,2 g/l-es koncentráció eléréséig. További egy óra inkubálás után (szobahőmérsékleten) a szolokat 30 percig centrifugáltuk (4000 g = 39 200 N/kg). A pelleteket 5 mmól NaCl/1 koncentrációjú, további adalékanyagot nem tartalmazó vagy 0,2 g CarbowaxR-20M/l vagy 0,2 g BSA/1 tartalmú oldattal 37 ml vígső térfogatra újra szuszpendáltuk. A különböző konjugátokat és a tiszta színezék szolokat az : .4 pontban ismertetett DIA-val („szendvics-vizsgálat”) vizsgáltuk. Az alkalmazott HCG hígítási sorozat: 0, 250, 1000 és 4000 IU (immuno-vizsgálat)/liter foszfátpuffrr. Konjugá' A5 1 6 HCG (Il /l) 0 250 1000 4000 10.2-a 0,579 0,773 0,722 0,480 b 0,165 0,178 0,165 0,166 c 0,621 0,967 1,300 1,591 Tiszta színezék szol 0,056--5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
